各位贤拜好！ 想请教一下常做双染的高手 一些关於compensation的问题 我先简述一下我的实验设计 我的实验本身是在做细胞Autophagocytosis 将一种细胞以apoptosis inducer诱导apoptosis之後 看活的细胞能否将凋亡的同种细胞进行apoptosis 用的大概方法如下 1.将活细胞以PKH67细胞膜染剂(绿萤光)进行染色 2.将欲被吞噬的活细胞或死细胞以PKH26细胞膜染剂(红萤光)进行染色 3.各别以BSA进行染色反应中止 4.将两种染好色的细胞混和进行吞噬 5.吞噬反应完成後wash再回溶上Flow以双染进行测定 其中在实验组别 在实验中欲看细胞死亡 是否会造成活细胞autophagocytosis有所增加 因此我以活细胞吞活细胞的组别为control 另设计下列四管用以调整flow设定 1.两种细胞均不染色 2.活细胞染色(PKH67) 欲被吞噬活细胞不染 3.活细胞不染 欲被吞噬活细胞染色(PKH 26) 4.双染Control 先上1.调整FSC.SSC.FL1-H.FL2-H至理想设定 之後这些设定就不动了 再分别上2.3调整Compensation 最後再上双染control看设定有无跑掉 之後就跑各实验组别 但调整过程中却发现 3.单染欲被吞噬活细胞染PKH 26这管 (档案中的第二张图) 怎麽调Compensation都没办法调进FL1-H到10^1以内 但调另一管单染活细胞的compensation(第三张图) 却可以很快的将FL2-H调到OK的程度 在不得已的状况下 在分析时只好把十字往右拉 再来看Double positive(表示细胞有被吞噬)的比例 想请问一下 这样的状况要如何调整设定? 很怕这样定量出来的data不准... 我把实验的图档以下列连结分享 http://ppt.cc/3MhU 另外我也找了一篇也是用这个染剂来做吞噬实验的paper 让各位高手来对照他的图来看我是否有地方没注意到 paper如下 http://ppt.cc/bvU2 主要是里面figure 4和6这两张图 麻烦各位高手指导 谢谢大家(跪~) --

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