作者jas123654 (jack)
看板Biotech
標題[討論] hif1 alpha實驗細節
時間Sat Sep 28 18:35:45 2013
請問板上有沒有大大正在壓hif1 alpha的
小弟目前已碩＂三＂
急需壓出這個蛋白質
但是follow前人步驟已五個月
最多只壓出positive control(CoCl2)
有沒有人有壓出來過可以分享整個流程與細節的
若我成功壓出來願意請吃西提一份
感恩！
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 118.169.215.4
1F：→ blence:postive有出來,negative沒看到,這兩個是做心酸的嗎？ 09/28 19:07
2F：→ jas123654:我只有三個組別 positive,加藥組，control組 09/28 19:19
3F：→ blence:你聽不懂問題,你有三組,pc有,nc沒有,test也沒有,所以test是 09/28 19:23
4F：→ blence:跟pc比較像?還是跟nc比較像? pc/nc不就是方便你判斷結果嗎? 09/28 19:24
5F：→ blence:你一直把focus放在押不出來,可是你的問題幾乎與技術無關阿 09/28 19:28
6F：→ blence:而是你該前人的實驗為真,或是FascaXXX真的有效這兩件事上 09/28 19:29
7F：→ jas123654:三組皆該有band(前人已有做出證明） 09/28 19:51
8F：→ jas123654:但nc非常淡，pc and test要比較強的訊號 09/28 19:52
9F：→ jas123654:我是懷疑是技術問題所以壓不出來 09/28 19:53
10F：推 aceliang:前人對還是positive control對，這個問題你還是沒回答 09/28 22:23
11F：→ aceliang:壓得出pc然後nc沒有，結論竟然是懷疑技術問題...呵呵 09/28 22:23
12F：推 mesenchymal:先假設前人結果為真且可重複,那你是不是也該懷疑你 09/28 22:30
13F：→ mesenchymal:細胞狀況跟藥的效果是否有變? 09/28 22:31
14F：→ jas123654:前人跟pc皆對阿！只要有band在120KDa就是對 09/28 22:54
15F：→ jas123654:以我的處理pc nc 加藥 三種都要在120KDa有band 強弱而已 09/28 22:55
16F：→ jas123654:細胞剛解凍不久 代數不高 就算藥物有壞好了 nc組也該要 09/28 22:57
17F：→ jas123654:因為endogenous 就有 並不是要induce才有 09/28 22:58
18F：→ jas123654:我懷疑自己技術是因為hif1很容易degrade 但我已盡量小心 09/28 22:59
19F：→ jas123654:所以不知道是不是有遺漏什麼 所以才想請教有做過的人 09/28 22:59
20F：→ blence:你是有沒有確認過細胞種類,load量,ECL品牌...等等所有東西 09/28 23:59
21F：→ blence:都跟前人一樣那才有相互比較的空間,不過都一樣的話幹嘛還補 09/29 00:00
22F：→ blence:這data就很有趣了,此外,你的這兩篇文應該要問如何看到HIF1 09/29 00:01
23F：→ jas123654:因為要repeat完 才能做接下來的實驗啊@@" 09/29 00:01
24F：→ blence:的endo level,結果發文內容完全不是提到這一點,卻都提加藥 09/29 00:02
25F：→ jas123654:我要對HIF的上游做調節 所以總要先押的到HIF 09/29 00:03
26F：→ jas123654:HIF 在ENDO是不斷被做出來又不斷被DEGRADE的蛋白 09/29 00:04
27F：→ jas123654:所以收lysate很容易不小心離開冰上就被分解 09/29 00:04
28F：→ jas123654:我的實驗室根據今年畢業同實驗室學長的題目做延伸 09/29 00:05
29F：→ jas123654:藥品不用說都是他留下來的 但是他人間蒸發 無法問到細節 09/29 00:05
30F：→ jas123654:我沒著重在加藥這件事上面....但是加藥組也是我要看的啊 09/29 00:07
31F：→ jas123654:我的加藥跟PC都是去抑制HIF被分解的途徑 09/29 00:08
32F：→ jas123654:所以一個有一個沒有BAND讓我很困惑!!! 09/29 00:08
33F：→ a90648:1.藥壞掉了 2.此藥無抑制分解效果 09/29 09:16
34F：推 HEK293:您對本實驗有預設立場，對此小弟我也很困惑。 09/30 08:50
35F：→ HEK293:既然你都說pc跟您使用的藥一樣都會抑制分解，結果卻不同 09/30 08:51
36F：→ HEK293:實在很難聯想到實驗手法問題，比較傾向細胞or藥or else 09/30 08:52
37F：→ jas123654:不是預設立場 是因為這是要repeat一個一模一樣的實驗 09/30 09:04
38F：→ jas123654:是半年前一個同lab的人做的論文data（目前已畢業已失聯 09/30 09:06
39F：推 tsubasawolfy:那就是他有問題啦 科科 09/30 16:08
40F：推 chench0710:那就是他有問題啦 科科 09/30 21:06
41F：推 mesenchymal:相信我,很多人即使他不是有意的,他的實驗結果仍然是 09/30 22:38
42F：→ mesenchymal:沒辦法重複甚至是相反的... 09/30 22:39
43F：→ mesenchymal:如果這結果你有看到其他paper做出類似的結果,那你 09/30 22:41
44F：→ mesenchymal:可以推測你的方法/材料出問題,所以再找找文獻吧 09/30 22:43
45F：→ blence:我也不覺得一定是前人的問題,因為原po連細節都不清楚未提及 09/30 23:22
46F：→ blence:一直在"這是repeat別人實驗"上跳針,那乾脆去八卦人肉還更快 09/30 23:22
47F：→ blence:如果清楚說明自己材料與方法很難,那要repeat實驗應該也不易 09/30 23:26
48F：推 ljii:生物實驗倒是三不五時會有那種in his hands only的結果 10/01 09:26
49F：→ vandia:印象中這個protein degrade很快,取蛋白盡量能多低溫就多低 10/02 11:12
50F：→ vandia:用液態氮更好 10/02 11:13