作者jas123654 (jack)
看板Biotech
标题[讨论] hif1 alpha实验细节
时间Sat Sep 28 18:35:45 2013
请问板上有没有大大正在压hif1 alpha的
小弟目前已硕＂三＂
急需压出这个蛋白质
但是follow前人步骤已五个月
最多只压出positive control(CoCl2)
有没有人有压出来过可以分享整个流程与细节的
若我成功压出来愿意请吃西提一份
感恩！
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 118.169.215.4
1F：→ blence:postive有出来,negative没看到,这两个是做心酸的吗？ 09/28 19:07
2F：→ jas123654:我只有三个组别 positive,加药组，control组 09/28 19:19
3F：→ blence:你听不懂问题,你有三组,pc有,nc没有,test也没有,所以test是 09/28 19:23
4F：→ blence:跟pc比较像?还是跟nc比较像? pc/nc不就是方便你判断结果吗? 09/28 19:24
5F：→ blence:你一直把focus放在押不出来,可是你的问题几乎与技术无关阿 09/28 19:28
6F：→ blence:而是你该前人的实验为真,或是FascaXXX真的有效这两件事上 09/28 19:29
7F：→ jas123654:三组皆该有band(前人已有做出证明） 09/28 19:51
8F：→ jas123654:但nc非常淡，pc and test要比较强的讯号 09/28 19:52
9F：→ jas123654:我是怀疑是技术问题所以压不出来 09/28 19:53
10F：推 aceliang:前人对还是positive control对，这个问题你还是没回答 09/28 22:23
11F：→ aceliang:压得出pc然後nc没有，结论竟然是怀疑技术问题...呵呵 09/28 22:23
12F：推 mesenchymal:先假设前人结果为真且可重复,那你是不是也该怀疑你 09/28 22:30
13F：→ mesenchymal:细胞状况跟药的效果是否有变? 09/28 22:31
14F：→ jas123654:前人跟pc皆对阿！只要有band在120KDa就是对 09/28 22:54
15F：→ jas123654:以我的处理pc nc 加药 三种都要在120KDa有band 强弱而已 09/28 22:55
16F：→ jas123654:细胞刚解冻不久 代数不高 就算药物有坏好了 nc组也该要 09/28 22:57
17F：→ jas123654:因为endogenous 就有 并不是要induce才有 09/28 22:58
18F：→ jas123654:我怀疑自己技术是因为hif1很容易degrade 但我已尽量小心 09/28 22:59
19F：→ jas123654:所以不知道是不是有遗漏什麽 所以才想请教有做过的人 09/28 22:59
20F：→ blence:你是有没有确认过细胞种类,load量,ECL品牌...等等所有东西 09/28 23:59
21F：→ blence:都跟前人一样那才有相互比较的空间,不过都一样的话干嘛还补 09/29 00:00
22F：→ blence:这data就很有趣了,此外,你的这两篇文应该要问如何看到HIF1 09/29 00:01
23F：→ jas123654:因为要repeat完 才能做接下来的实验啊@@" 09/29 00:01
24F：→ blence:的endo level,结果发文内容完全不是提到这一点,却都提加药 09/29 00:02
25F：→ jas123654:我要对HIF的上游做调节 所以总要先押的到HIF 09/29 00:03
26F：→ jas123654:HIF 在ENDO是不断被做出来又不断被DEGRADE的蛋白 09/29 00:04
27F：→ jas123654:所以收lysate很容易不小心离开冰上就被分解 09/29 00:04
28F：→ jas123654:我的实验室根据今年毕业同实验室学长的题目做延伸 09/29 00:05
29F：→ jas123654:药品不用说都是他留下来的 但是他人间蒸发 无法问到细节 09/29 00:05
30F：→ jas123654:我没着重在加药这件事上面....但是加药组也是我要看的啊 09/29 00:07
31F：→ jas123654:我的加药跟PC都是去抑制HIF被分解的途径 09/29 00:08
32F：→ jas123654:所以一个有一个没有BAND让我很困惑!!! 09/29 00:08
33F：→ a90648:1.药坏掉了 2.此药无抑制分解效果 09/29 09:16
34F：推 HEK293:您对本实验有预设立场，对此小弟我也很困惑。 09/30 08:50
35F：→ HEK293:既然你都说pc跟您使用的药一样都会抑制分解，结果却不同 09/30 08:51
36F：→ HEK293:实在很难联想到实验手法问题，比较倾向细胞or药or else 09/30 08:52
37F：→ jas123654:不是预设立场 是因为这是要repeat一个一模一样的实验 09/30 09:04
38F：→ jas123654:是半年前一个同lab的人做的论文data（目前已毕业已失联 09/30 09:06
39F：推 tsubasawolfy:那就是他有问题啦 科科 09/30 16:08
40F：推 chench0710:那就是他有问题啦 科科 09/30 21:06
41F：推 mesenchymal:相信我,很多人即使他不是有意的,他的实验结果仍然是 09/30 22:38
42F：→ mesenchymal:没办法重复甚至是相反的... 09/30 22:39
43F：→ mesenchymal:如果这结果你有看到其他paper做出类似的结果,那你 09/30 22:41
44F：→ mesenchymal:可以推测你的方法/材料出问题,所以再找找文献吧 09/30 22:43
45F：→ blence:我也不觉得一定是前人的问题,因为原po连细节都不清楚未提及 09/30 23:22
46F：→ blence:一直在"这是repeat别人实验"上跳针,那乾脆去八卦人肉还更快 09/30 23:22
47F：→ blence:如果清楚说明自己材料与方法很难,那要repeat实验应该也不易 09/30 23:26
48F：推 ljii:生物实验倒是三不五时会有那种in his hands only的结果 10/01 09:26
49F：→ vandia:印象中这个protein degrade很快,取蛋白尽量能多低温就多低 10/02 11:12
50F：→ vandia:用液态氮更好 10/02 11:13