※ 引述《truthPP (就是真理)》之銘言： 晚上睡不著.... 以下用自己的經驗來回答一下 : 大家好 : 詳細圖檔於下列網址內 : http://ppt.cc/N7Cy : (如果PCMAN開不了換至Google chrome應該ok) : 實際的實驗內容我在先前annexin V/7AAD的提問(15388篇)中有說明 : 今天做完的結果 : 感覺好像設定上還是沒抓到竅門 : 所以前來請有做過Annexin V/7AAD的高手指導一下 : 先簡單說明圖中各項組別 : (A)未染色的活細胞Control 其實control組應該還是要加dye下去染的 才算真正的control 就像一般的flow實驗要加isotype IgG conjugated dye一樣 先用FSC和SSC gate出主要的活細胞群 如果你是用BD canto以上等級的機器 還可以再用FSC-A和FSC-W 把不是單一細胞的群落去除 上機的時候記得在DIVA軟體中把A和W的訊號參數打勾就好 因為你沒有任何的treatment 這樣加dye下去染色後的data才算真正的control (我不確定calibur能不能測到W的數值) : (B)照射UV後4小時的細胞單染Annexin V : (C)照射UV後4小時的細胞單染7-AAD : (D)雙染Annexin V及7-AAD的活細胞Control : 上述四組用於調整設定 : (E)照射UV後4小時的細胞雙染Annexin V以及7-AAD : (F)加入誘導凋亡藥物5nM兩小時後的細胞雙染Annexin V以及7-AAD : (G)加入誘導凋亡藥物50nM兩小時後的細胞雙染Annexin V以及7-AAD : 上述三組為實驗組 : Flow上機後調整的方式為 : 1.先上未染色活細胞control(形成A圖) : 目的:調整FSC/SSC以及FL2跟FL3至理想區域及象限 FL2和FL3 gain值再調大點吧 positive 訊號到10^3會比較清楚 甚至你可以分出早期和晚期的apoptotic cell : 2.上照射UV後4小時的細胞單染Annexin V : 目的:調整FL3-FL2 compensation : 3.上照射UV後4小時的細胞單染7-AAD : 目的:調整FL2-FL3 compensation : compensation最終設定大約值是 : FL3-FL2=14% : FL2-FL3=28% 要做螢光補償前 要先把 1.FSC和SSC的gating範圍先確定 2.FL2和FL3的gain要調到有明顯positive訊號的值 再來做補償才會準 以你的圖完全沒做gating來看的話 我看圖中的FL3螢光補償還不夠喔 因為單染7AAD的positive訊號還是斜的... 至少要把C圖中的FL3 postive訊號拉回FL2 10^1以後的位置 但前提是你一定要先確定你的gate範圍 因為細胞碎片和aggregated cell會影響螢光補償的結果 (像是SSC-H最上面那一排密密麻麻的訊號...) 尤其是當你要的positive細胞只有1%以下又是拖尾訊號的話 就一定要注意 : 4.上雙染Annexin V及7-AAD的活細胞Control : 目的:確認十字範圍設定baseline 這才算真正的control(就是D圖) 你看你的A和D圖形就不一樣了 好的negative control A和D的圖形要差不多才是 : 5.完成設定後依序上後續實驗組 : 跑完後對data的疑問 : 1.照射UV的細胞感覺好像沒甚麼死= = : 在跑UV單染的圖出來時 : 當下的反應是 : X!(消音)不會沒染上吧? : 但後來看到藥物組的圖形有出來 : 感覺應該是有染上 : 反而更疑惑UV組到底出甚麼問題 從FSC-SSC看起來死蠻大的啊XD 一堆細胞碎片和屍體 : 2.UV部分的Data感覺細胞群好難抓 所以先沒有gate : 不知道這邊的細胞能Gate哪一塊區域? http://ppt.cc/SByv 這是你第一組的圖 紅色部分表示形態正常的細胞 藍色部分代表正常處理下產生的細胞碎片 照你UV組的圖來圈的話 如果是我 我會圈綠色部分來gate 如果你保守一點 也可以用紅色部分來做gate : 3.實驗的組別設計上 不知道大家看完有沒有覺得哪邊有問題? : 會不會是實驗組別設計上(特別是調整設定哪幾管)的問題 : 才會導致圖形變這樣 UV induced apoptosis我記得不同燈管瓦數放的時間也不一樣 還有你放的距離等等都有關係 建議你先去找一個positive control 先確定SOP Jurkat 應該是個理想的cell line 然後把你的target cell的gate和螢光補償搞定再來看吧 : 4.一般來說染色的時間大家大概最長到多少? : 我從下Annexin V/7AAD到上機是15分鐘 冰上15分OK 如果你跑sample需要很久的時間 細胞fix之後再上也可以 0.4%paraformaldehyde in PBS solution很好用 配製方法去估狗一下就行了 調PH值很麻煩而已 實驗室很有錢就買commercial的就好 : 目前這組DATA唯一給我的好消息是 : 如果他是OK的 : 那藥物組(G)可能就是我要的條件 : 但那也要DATA是OK的 T皿T : 而且看到UV組的圖是那樣好像都還活得好好的感覺 冏 FSC和SSC的圖看起來活得不怎麼好啊XD 不用太擔心啦 要相信你的UV燈管啊!!! : 希望大家能對我設定上以及實驗組別設計的部分給我建議 : 因為這細胞凋亡條件對我來說很重要 : 懇請大家幫忙 : 先跟大家說聲謝謝 --

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