※ 引述《truthPP (就是真理)》之铭言： 晚上睡不着.... 以下用自己的经验来回答一下 : 大家好 : 详细图档於下列网址内 : http://ppt.cc/N7Cy : (如果PCMAN开不了换至Google chrome应该ok) : 实际的实验内容我在先前annexin V/7AAD的提问(15388篇)中有说明 : 今天做完的结果 : 感觉好像设定上还是没抓到窍门 : 所以前来请有做过Annexin V/7AAD的高手指导一下 : 先简单说明图中各项组别 : (A)未染色的活细胞Control 其实control组应该还是要加dye下去染的 才算真正的control 就像一般的flow实验要加isotype IgG conjugated dye一样 先用FSC和SSC gate出主要的活细胞群 如果你是用BD canto以上等级的机器 还可以再用FSC-A和FSC-W 把不是单一细胞的群落去除 上机的时候记得在DIVA软体中把A和W的讯号参数打勾就好 因为你没有任何的treatment 这样加dye下去染色後的data才算真正的control (我不确定calibur能不能测到W的数值) : (B)照射UV後4小时的细胞单染Annexin V : (C)照射UV後4小时的细胞单染7-AAD : (D)双染Annexin V及7-AAD的活细胞Control : 上述四组用於调整设定 : (E)照射UV後4小时的细胞双染Annexin V以及7-AAD : (F)加入诱导凋亡药物5nM两小时後的细胞双染Annexin V以及7-AAD : (G)加入诱导凋亡药物50nM两小时後的细胞双染Annexin V以及7-AAD : 上述三组为实验组 : Flow上机後调整的方式为 : 1.先上未染色活细胞control(形成A图) : 目的:调整FSC/SSC以及FL2跟FL3至理想区域及象限 FL2和FL3 gain值再调大点吧 positive 讯号到10^3会比较清楚 甚至你可以分出早期和晚期的apoptotic cell : 2.上照射UV後4小时的细胞单染Annexin V : 目的:调整FL3-FL2 compensation : 3.上照射UV後4小时的细胞单染7-AAD : 目的:调整FL2-FL3 compensation : compensation最终设定大约值是 : FL3-FL2=14% : FL2-FL3=28% 要做萤光补偿前 要先把 1.FSC和SSC的gating范围先确定 2.FL2和FL3的gain要调到有明显positive讯号的值 再来做补偿才会准 以你的图完全没做gating来看的话 我看图中的FL3萤光补偿还不够喔 因为单染7AAD的positive讯号还是斜的... 至少要把C图中的FL3 postive讯号拉回FL2 10^1以後的位置 但前提是你一定要先确定你的gate范围 因为细胞碎片和aggregated cell会影响萤光补偿的结果 (像是SSC-H最上面那一排密密麻麻的讯号...) 尤其是当你要的positive细胞只有1%以下又是拖尾讯号的话 就一定要注意 : 4.上双染Annexin V及7-AAD的活细胞Control : 目的:确认十字范围设定baseline 这才算真正的control(就是D图) 你看你的A和D图形就不一样了 好的negative control A和D的图形要差不多才是 : 5.完成设定後依序上後续实验组 : 跑完後对data的疑问 : 1.照射UV的细胞感觉好像没甚麽死= = : 在跑UV单染的图出来时 : 当下的反应是 : X!(消音)不会没染上吧? : 但後来看到药物组的图形有出来 : 感觉应该是有染上 : 反而更疑惑UV组到底出甚麽问题 从FSC-SSC看起来死蛮大的啊XD 一堆细胞碎片和屍体 : 2.UV部分的Data感觉细胞群好难抓 所以先没有gate : 不知道这边的细胞能Gate哪一块区域? http://ppt.cc/SByv 这是你第一组的图 红色部分表示形态正常的细胞 蓝色部分代表正常处理下产生的细胞碎片 照你UV组的图来圈的话 如果是我 我会圈绿色部分来gate 如果你保守一点 也可以用红色部分来做gate : 3.实验的组别设计上 不知道大家看完有没有觉得哪边有问题? : 会不会是实验组别设计上(特别是调整设定哪几管)的问题 : 才会导致图形变这样 UV induced apoptosis我记得不同灯管瓦数放的时间也不一样 还有你放的距离等等都有关系 建议你先去找一个positive control 先确定SOP Jurkat 应该是个理想的cell line 然後把你的target cell的gate和萤光补偿搞定再来看吧 : 4.一般来说染色的时间大家大概最长到多少? : 我从下Annexin V/7AAD到上机是15分钟 冰上15分OK 如果你跑sample需要很久的时间 细胞fix之後再上也可以 0.4%paraformaldehyde in PBS solution很好用 配制方法去估狗一下就行了 调PH值很麻烦而已 实验室很有钱就买commercial的就好 : 目前这组DATA唯一给我的好消息是 : 如果他是OK的 : 那药物组(G)可能就是我要的条件 : 但那也要DATA是OK的 T皿T : 而且看到UV组的图是那样好像都还活得好好的感觉 冏 FSC和SSC的图看起来活得不怎麽好啊XD 不用太担心啦 要相信你的UV灯管啊!!! : 希望大家能对我设定上以及实验组别设计的部分给我建议 : 因为这细胞凋亡条件对我来说很重要 : 恳请大家帮忙 : 先跟大家说声谢谢 --

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