各位這裡的賢拜大家好 最近因為要做細胞凋亡情形監測的實驗 目前實驗室現有的材料是 PE-Annexin V 7-AAD 故打算以此兩種現有材料對細胞進行雙染上Flow 但因為我自己本身大多做單染比較多 做雙染的經驗很少 有爬過文 參考先前賢拜的方法 但設計過程仍有些問題上來請教 目前protocol暫定設定如下 凋亡細胞以UV以及誘發細胞凋亡藥物引發凋亡 1.各組取前置細胞數1x10^6 2.將細胞離心後以PBS Wash 1次 3.將細胞回溶於Annexin V binding buffer 100ul 4.加入Annexin V 10ul以及7AAD 5ul在冰上進行15分鐘染色 5.各管加入400ul binding buffer直接上機 組別部分 分為 Control部分(活細胞) 1.不染control 2.Annexin V+7AAD雙染 control Positive control部分(死細胞) 1.Annexin V+7AAD雙染 2.Annexin V單染 3.7AAD單染 實驗組 1.UV treat後細胞 雙染 2.藥物濃度A Treat後細胞 雙染 3.藥物濃度B Treat後細胞 雙染 上flow後的校正(X軸訂為FL2-H Y軸為FL3-H) 1.先上雙染control調整至左下角象限 2.上positive control 單染annexin V看是否會出現於左下及右下象限 3.上positive control 單染7AAD 看是否會出現於左下以及左上象限 4.上Positive雙染觀察細胞坐落象限是否正確 5.上不染control看setting有沒有跑掉 問題點: 1.Protocol的部分Annexin V和7AAD可同時加入進行染色嗎? 因為有看過別家實驗室的Protocol是先染Annexin V 15mins之後 再加入7AAD 但也有看過同時加的 想請問這樣的用意差在哪邊? 2.染色時一般來說要在冰上還是室溫比較好? 一種說法是冰上可以防止Protein degrade 一種說法則是室溫時蛋白質的活性比在冰上好 而且只染15分鐘 室溫應該不太會有太大影響 3.實驗設計Control組的部分要以活細胞為設計對象應該沒錯吧? 因為自己本身想法是活細胞 PS不會外翻 不會接上Annexin V 膜也完整 7AAD不會染到核 故以活細胞作為Control 4.Positive control的設計條件是我比較傷腦筋的 想請問一下各位這邊會讓細胞怎麼死?要死的多極端? 還是直接拿其中一組實驗組做positive control? 5.Flow設定調整校正順序是否有需要調整的地方? 另外就是因為是雙染 可能會調整到compensation 在這邊 有做過的賢拜大多是調整FL2H-FL3H%還是FL3H-FL2H? 有耳聞Annexin V+7AAD雙染設定調整是關鍵 也非常不好調 麻煩有做過的各位指導小弟一下 非常謝謝!!!! 為表感謝 回文或推文回覆者均給予200P --

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