各位这里的贤拜大家好 最近因为要做细胞凋亡情形监测的实验 目前实验室现有的材料是 PE-Annexin V 7-AAD 故打算以此两种现有材料对细胞进行双染上Flow 但因为我自己本身大多做单染比较多 做双染的经验很少 有爬过文 参考先前贤拜的方法 但设计过程仍有些问题上来请教 目前protocol暂定设定如下 凋亡细胞以UV以及诱发细胞凋亡药物引发凋亡 1.各组取前置细胞数1x10^6 2.将细胞离心後以PBS Wash 1次 3.将细胞回溶於Annexin V binding buffer 100ul 4.加入Annexin V 10ul以及7AAD 5ul在冰上进行15分钟染色 5.各管加入400ul binding buffer直接上机 组别部分 分为 Control部分(活细胞) 1.不染control 2.Annexin V+7AAD双染 control Positive control部分(死细胞) 1.Annexin V+7AAD双染 2.Annexin V单染 3.7AAD单染 实验组 1.UV treat後细胞 双染 2.药物浓度A Treat後细胞 双染 3.药物浓度B Treat後细胞 双染 上flow後的校正(X轴订为FL2-H Y轴为FL3-H) 1.先上双染control调整至左下角象限 2.上positive control 单染annexin V看是否会出现於左下及右下象限 3.上positive control 单染7AAD 看是否会出现於左下以及左上象限 4.上Positive双染观察细胞坐落象限是否正确 5.上不染control看setting有没有跑掉 问题点: 1.Protocol的部分Annexin V和7AAD可同时加入进行染色吗? 因为有看过别家实验室的Protocol是先染Annexin V 15mins之後 再加入7AAD 但也有看过同时加的 想请问这样的用意差在哪边? 2.染色时一般来说要在冰上还是室温比较好? 一种说法是冰上可以防止Protein degrade 一种说法则是室温时蛋白质的活性比在冰上好 而且只染15分钟 室温应该不太会有太大影响 3.实验设计Control组的部分要以活细胞为设计对象应该没错吧? 因为自己本身想法是活细胞 PS不会外翻 不会接上Annexin V 膜也完整 7AAD不会染到核 故以活细胞作为Control 4.Positive control的设计条件是我比较伤脑筋的 想请问一下各位这边会让细胞怎麽死?要死的多极端? 还是直接拿其中一组实验组做positive control? 5.Flow设定调整校正顺序是否有需要调整的地方? 另外就是因为是双染 可能会调整到compensation 在这边 有做过的贤拜大多是调整FL2H-FL3H%还是FL3H-FL2H? 有耳闻Annexin V+7AAD双染设定调整是关键 也非常不好调 麻烦有做过的各位指导小弟一下 非常谢谢!!!! 为表感谢 回文或推文回覆者均给予200P --

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