作者jonsauwi (JBY)
看板Biotech
標題[求救] Protein A/G column elution
時間Wed Aug 21 09:42:18 2013
最近用protein A/G column 純化抗體，
以前在loading、wash之後，都是用Gly-HCl buffer（0.1M, pH=2.5~3）做elution，
但由於現在純化出來的抗體是要用於治療（現階段是要注射小鼠），
所以不能含有Gly，在使用前必須置換成PBS，
老師認為太麻煩，而且置換的過程中又會造成一些loss，
靈機一動說如果直接用HCl來elution就好了，
但是我查了一下還沒見過有人用HCl來elute抗體的，
（也有看到人在問同樣的事情，但沒有得到解答）
所以使用的濃度和中和用的buffer等等都不能確定，
不知道是否有人使用過這種方法elute protein A/G上的抗體？可否分享一下？謝謝！
P.S.
老師原本是提議用0.1M的HCl，然後每0.5mL/fraction，
每fraction事先加入20μL的PBS（1M, pH=7.2）來中和。
但是經過我的計算和實驗後發現這樣根本沒辦法中和，
（elution buffer的pH=1了，中和之後才升到pH=2.0x）
於是我自己改成0.01M的HCl（實驗ok，pH=2，也接近本來用Gly elute的pH值），
結果老師認為Gly都是用0.1M，隨便改成0.01M搞不好會elute不出來，
要我再去試0.1M的條件...
但是我推測即使把中和液加到100μL，大概也只能升到pH~5而已...
雖然說已經沒那麼酸了，但在這樣的環境總還是沒辦法太過穩定。
何況一下子就用pH=1的溶液去elute，
我也擔心會不會一elute出來馬上就denature，然後就卡在protein A/G的beads上這樣。
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◆ From: 140.109.55.225
※ 編輯: jonsauwi 來自: 140.109.55.225 (08/21 09:44)
1F：→ trumpet:第一次聽到用PBS來"中和"酸.... 08/21 13:16
2F：→ trumpet:網路上很容易查到各種buffer適合的pH，citrate, acetate.. 08/21 13:17
3F：→ trumpet:直接用HCl有點過頭.... 08/21 13:21
我聽到老師說要用這方法的時候也很囧啊，
因為之前從來沒這樣做過，也沒看別人這樣做過。
4F：推 jsi:純化出來後，再透析置換成所需的溶劑 08/21 22:09
5F：→ jsi:sorry~沒注意到原po說置換過程麻煩及會loss 08/21 22:12
6F：推 joseph103331:HCl水溶液大概不能稱為buffer.....XD 08/21 23:25
7F：→ joseph103331:與其靈機一動 不如照推薦方法做做看 或者是直接去看 08/21 23:26
8F：→ joseph103331:別人的trouble shooting (產率過低之類的) 08/21 23:27
因為老師現在興致勃勃地想用這種方法做做看，
要不然本來用Gly的方法用得好好的我也不想換...（雖然換buffer步驟真的很麻煩）
我是想或許可以一試，真的不行當然就換回原本的方法，
但是又想到若是失敗那拿來測試的antibody和beads就損失大了。
※ 編輯: jonsauwi 來自: 140.109.55.225 (08/22 11:39)