作者jonsauwi (JBY)
看板Biotech
标题[求救] Protein A/G column elution
时间Wed Aug 21 09:42:18 2013
最近用protein A/G column 纯化抗体，
以前在loading、wash之後，都是用Gly-HCl buffer（0.1M, pH=2.5~3）做elution，
但由於现在纯化出来的抗体是要用於治疗（现阶段是要注射小鼠），
所以不能含有Gly，在使用前必须置换成PBS，
老师认为太麻烦，而且置换的过程中又会造成一些loss，
灵机一动说如果直接用HCl来elution就好了，
但是我查了一下还没见过有人用HCl来elute抗体的，
（也有看到人在问同样的事情，但没有得到解答）
所以使用的浓度和中和用的buffer等等都不能确定，
不知道是否有人使用过这种方法elute protein A/G上的抗体？可否分享一下？谢谢！
P.S.
老师原本是提议用0.1M的HCl，然後每0.5mL/fraction，
每fraction事先加入20μL的PBS（1M, pH=7.2）来中和。
但是经过我的计算和实验後发现这样根本没办法中和，
（elution buffer的pH=1了，中和之後才升到pH=2.0x）
於是我自己改成0.01M的HCl（实验ok，pH=2，也接近本来用Gly elute的pH值），
结果老师认为Gly都是用0.1M，随便改成0.01M搞不好会elute不出来，
要我再去试0.1M的条件...
但是我推测即使把中和液加到100μL，大概也只能升到pH~5而已...
虽然说已经没那麽酸了，但在这样的环境总还是没办法太过稳定。
何况一下子就用pH=1的溶液去elute，
我也担心会不会一elute出来马上就denature，然後就卡在protein A/G的beads上这样。
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.55.225
※ 编辑: jonsauwi 来自: 140.109.55.225 (08/21 09:44)
1F：→ trumpet:第一次听到用PBS来"中和"酸.... 08/21 13:16
2F：→ trumpet:网路上很容易查到各种buffer适合的pH，citrate, acetate.. 08/21 13:17
3F：→ trumpet:直接用HCl有点过头.... 08/21 13:21
我听到老师说要用这方法的时候也很囧啊，
因为之前从来没这样做过，也没看别人这样做过。
4F：推 jsi:纯化出来後，再透析置换成所需的溶剂 08/21 22:09
5F：→ jsi:sorry~没注意到原po说置换过程麻烦及会loss 08/21 22:12
6F：推 joseph103331:HCl水溶液大概不能称为buffer.....XD 08/21 23:25
7F：→ joseph103331:与其灵机一动 不如照推荐方法做做看 或者是直接去看 08/21 23:26
8F：→ joseph103331:别人的trouble shooting (产率过低之类的) 08/21 23:27
因为老师现在兴致勃勃地想用这种方法做做看，
要不然本来用Gly的方法用得好好的我也不想换...（虽然换buffer步骤真的很麻烦）
我是想或许可以一试，真的不行当然就换回原本的方法，
但是又想到若是失败那拿来测试的antibody和beads就损失大了。
※ 编辑: jonsauwi 来自: 140.109.55.225 (08/22 11:39)