作者wig152003 (dusky)
看板Biotech
標題[求救] ELISA做得很爛，老闆快抓狂 Q-Q
時間Tue Aug 20 21:59:27 2013
餓死抬頭……
接下這個任務也大半年了，但是做得依然很爛，也不知道是哪裡有問題
所以才上來請各位幫幫小妹我(跪)
我的實驗是用ELISA測定Plasma中的3-Nitrotyrosine濃度
先前情提要一下，我以前完全沒做過ELISA，在這部份我完全NEW
使用的KIT是CUSABIO的，使用的八爪是Eppendorf家的
原廠建議是用4-parameter去計算(我的愚婦腦袋只知道線性，對這玩意兒真的沒概念)
最低可偵測範圍是0.156 ng/ml
起初開始做的時候是duplicate的CV太大
但是我看了看data，我覺得是因為檢體的OD值都很低的關係，差一點點CV就爆20%了
雖然對結果的計算是沒差，因為duplicate的結果都是<0.156ng/ml
但老闆說「不行」!!!手法穩的話應該可以控制在20%以內
為了這20%我真的都快哭了……
我加完檢體後就37度 incubation 2小時，完了之後接著就是把檢體直接甩掉拍乾
原廠說明書是寫不用wash
不知道是不是因為這個步驟的關係造成CV過大
所以後來我都先用八爪把大部份檢體吸出來後再拍乾
雖然有改善，但老闆還是覺得CV不該是這樣，應該要更小更漂亮才對
他覺得我是做分生的平常都1ul、2ul在加，現在給我加100ul應該沒問題
CV應該要更小
想請問大家在拍乾plate的時候有什麼訣竅嗎?
我都覺得每次拍的時候都會交互汙染的感覺
我看其他人都是直接倒扣，然後就開始啪啪啪狂拍
這樣真的不會交互汙染嗎????
最近一次操作的問題是我的4套QC中有2套沒過，還跟Target value 差很多...
而這沒過的2套都是放在第3條well，我真的不知道是發生什麼事了…
但這次老闆似乎非常的生氣……
kit很貴，但我卻一直做不好
打到這心情又好down
先謝謝大家看完
因為現在手上沒有實驗的data，等明天到實驗室再補上來請大家幫我看一下
現在整個一團亂，很沒有頭緒的感覺也不知道是哪裡有問題
再次 感謝大家看完我的落落長廢話
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 1.171.165.235
1F：→ raiyu:sample可以4度 overnight (其實我也是小嫩嫩) 08/20 22:32
2F：推 snowcyn32:我也覺得4度 overnight做出來比較漂亮 08/20 22:53
3F：→ snowcyn32:拍乾也是劈哩啪啦亂拍 08/20 22:53
4F：→ e123917123:盡量垂直朝下 比較不會污染 拍乾底部墊衛生紙 拍過後再 08/20 23:36
5F：→ e123917123:換另一面乾淨衛生紙部分去拍 應該不會污染 做這個 寧可 08/20 23:37
6F：→ e123917123:多浪費點衛生紙 為求實驗精準 08/20 23:37
7F：→ e123917123:有的人做就是固定定點的拍 但是我都怕污染別的well 所 08/20 23:39
8F：→ e123917123:以會一直換紙 08/20 23:39
9F：→ gundamhaha:盤子底面有乾淨嗎? 08/21 08:53
10F：→ wig152003:是說我在讀OD值之前都會先把WELL底部擦一下欸~ 08/21 13:28
11F：→ formoxa:做VEGF這種簡單的不用4度就很漂亮了 08/21 16:07
12F：→ jsi:閱讀了幾家廠商的3-NT ELISA protocol，發現大多是在加sample 08/21 23:32
13F：→ jsi:的步驟就同時加入detection solution，您用的產品步驟是remove 08/21 23:34
14F：→ jsi:the liquid, don't wash.大概是3-NT不容易與capture Ab or 08/21 23:35
15F：→ jsi:something結合，所以使用remove一字而不寫aspirate，大概須小 08/21 23:37
16F：→ jsi:心移除liquid,不要再拍打吸乾，就進入下一步驟。 08/21 23:40
17F：推 flyninja:有個問題想借此文發問 我的kit在wash的時候well內會有約 08/22 00:56
18F：→ flyninja:300 ul的wash buffer 前陣子做也都是直接垂直朝下倒掉 08/22 00:57
19F：→ flyninja:發現好像還是會有溢出的現象 因為盤子邊邊都濕濕 08/22 00:58
20F：→ flyninja:後來有嘗試過先把wash buffer先用八抓吸掉再倒 就有改善 08/22 00:59
21F：→ flyninja:只是這樣是每吸完一排 就要換一次tip嗎？不然還是會有 08/22 01:00
22F：→ flyninja:交叉污染的現象？ 08/22 01:01
23F：推 planter:要注意八爪的TIP有沒有插緊 否則有些WELL會少加很多 08/22 09:04
24F：推 ararthur:同一支八爪有人用過嗎? 會不會已經不準了 08/23 12:17
25F：推 jsi:真的會因此而交叉汙染嗎?我用R&D ELISA kit說明書裡講到wash 08/24 17:22
26F：→ jsi:有一種方式是用洗瓶將buffer灌到well中wash,不要直沖well底面 08/24 17:24
27F：→ jsi:之後甩掉buffer,並在擦手紙上拍打,這個方法沒有問題。倒是要注 08/24 17:25
28F：→ jsi:意若沒有拍乾(指well中沒有殘留液體，並非完全乾燥)實驗數據再 08/24 17:27
29F：→ jsi:現性不佳。實地看別人全程操作一次或換手做做看，可略知是產品 08/24 17:29
30F：→ jsi:有問題抑或操作手法待改善。 08/24 17:30
31F：推 duncanfang:八爪使用前可以檢查一下O ring ,把tip插緊（不管吸 08/27 08:02
32F：→ duncanfang:或加都一樣） 08/27 08:02
33F：→ gestapo:實驗室有其它前輩做出過嗎？ 08/28 15:07