作者wig152003 (dusky)
看板Biotech
标题[求救] ELISA做得很烂，老板快抓狂 Q-Q
时间Tue Aug 20 21:59:27 2013
饿死抬头……
接下这个任务也大半年了，但是做得依然很烂，也不知道是哪里有问题
所以才上来请各位帮帮小妹我(跪)
我的实验是用ELISA测定Plasma中的3-Nitrotyrosine浓度
先前情提要一下，我以前完全没做过ELISA，在这部份我完全NEW
使用的KIT是CUSABIO的，使用的八爪是Eppendorf家的
原厂建议是用4-parameter去计算(我的愚妇脑袋只知道线性，对这玩意儿真的没概念)
最低可侦测范围是0.156 ng/ml
起初开始做的时候是duplicate的CV太大
但是我看了看data，我觉得是因为检体的OD值都很低的关系，差一点点CV就爆20%了
虽然对结果的计算是没差，因为duplicate的结果都是<0.156ng/ml
但老板说「不行」!!!手法稳的话应该可以控制在20%以内
为了这20%我真的都快哭了……
我加完检体後就37度 incubation 2小时，完了之後接着就是把检体直接甩掉拍乾
原厂说明书是写不用wash
不知道是不是因为这个步骤的关系造成CV过大
所以後来我都先用八爪把大部份检体吸出来後再拍乾
虽然有改善，但老板还是觉得CV不该是这样，应该要更小更漂亮才对
他觉得我是做分生的平常都1ul、2ul在加，现在给我加100ul应该没问题
CV应该要更小
想请问大家在拍乾plate的时候有什麽诀窍吗?
我都觉得每次拍的时候都会交互污染的感觉
我看其他人都是直接倒扣，然後就开始啪啪啪狂拍
这样真的不会交互污染吗????
最近一次操作的问题是我的4套QC中有2套没过，还跟Target value 差很多...
而这没过的2套都是放在第3条well，我真的不知道是发生什麽事了…
但这次老板似乎非常的生气……
kit很贵，但我却一直做不好
打到这心情又好down
先谢谢大家看完
因为现在手上没有实验的data，等明天到实验室再补上来请大家帮我看一下
现在整个一团乱，很没有头绪的感觉也不知道是哪里有问题
再次 感谢大家看完我的落落长废话
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 1.171.165.235
1F：→ raiyu:sample可以4度 overnight (其实我也是小嫩嫩) 08/20 22:32
2F：推 snowcyn32:我也觉得4度 overnight做出来比较漂亮 08/20 22:53
3F：→ snowcyn32:拍乾也是劈哩啪啦乱拍 08/20 22:53
4F：→ e123917123:尽量垂直朝下 比较不会污染 拍乾底部垫卫生纸 拍过後再 08/20 23:36
5F：→ e123917123:换另一面乾净卫生纸部分去拍 应该不会污染 做这个 宁可 08/20 23:37
6F：→ e123917123:多浪费点卫生纸 为求实验精准 08/20 23:37
7F：→ e123917123:有的人做就是固定定点的拍 但是我都怕污染别的well 所 08/20 23:39
8F：→ e123917123:以会一直换纸 08/20 23:39
9F：→ gundamhaha:盘子底面有乾净吗? 08/21 08:53
10F：→ wig152003:是说我在读OD值之前都会先把WELL底部擦一下欸~ 08/21 13:28
11F：→ formoxa:做VEGF这种简单的不用4度就很漂亮了 08/21 16:07
12F：→ jsi:阅读了几家厂商的3-NT ELISA protocol，发现大多是在加sample 08/21 23:32
13F：→ jsi:的步骤就同时加入detection solution，您用的产品步骤是remove 08/21 23:34
14F：→ jsi:the liquid, don't wash.大概是3-NT不容易与capture Ab or 08/21 23:35
15F：→ jsi:something结合，所以使用remove一字而不写aspirate，大概须小 08/21 23:37
16F：→ jsi:心移除liquid,不要再拍打吸乾，就进入下一步骤。 08/21 23:40
17F：推 flyninja:有个问题想借此文发问 我的kit在wash的时候well内会有约 08/22 00:56
18F：→ flyninja:300 ul的wash buffer 前阵子做也都是直接垂直朝下倒掉 08/22 00:57
19F：→ flyninja:发现好像还是会有溢出的现象 因为盘子边边都湿湿 08/22 00:58
20F：→ flyninja:後来有尝试过先把wash buffer先用八抓吸掉再倒 就有改善 08/22 00:59
21F：→ flyninja:只是这样是每吸完一排 就要换一次tip吗？不然还是会有 08/22 01:00
22F：→ flyninja:交叉污染的现象？ 08/22 01:01
23F：推 planter:要注意八爪的TIP有没有插紧 否则有些WELL会少加很多 08/22 09:04
24F：推 ararthur:同一支八爪有人用过吗? 会不会已经不准了 08/23 12:17
25F：推 jsi:真的会因此而交叉污染吗?我用R&D ELISA kit说明书里讲到wash 08/24 17:22
26F：→ jsi:有一种方式是用洗瓶将buffer灌到well中wash,不要直冲well底面 08/24 17:24
27F：→ jsi:之後甩掉buffer,并在擦手纸上拍打,这个方法没有问题。倒是要注 08/24 17:25
28F：→ jsi:意若没有拍乾(指well中没有残留液体，并非完全乾燥)实验数据再 08/24 17:27
29F：→ jsi:现性不佳。实地看别人全程操作一次或换手做做看，可略知是产品 08/24 17:29
30F：→ jsi:有问题抑或操作手法待改善。 08/24 17:30
31F：推 duncanfang:八爪使用前可以检查一下O ring ,把tip插紧（不管吸 08/27 08:02
32F：→ duncanfang:或加都一样） 08/27 08:02
33F：→ gestapo:实验室有其它前辈做出过吗？ 08/28 15:07