作者jordan01405 (空)
看板Biotech
標題[求救] 關於shRNA knockdown效果
時間Thu Aug 15 23:52:01 2013
大家好，小弟我最近實驗遇到些問題
我用shRNA 去knockdown，前面的塗盤養菌都OK
1.抽plasmid，濃度和定序OK
2.transfect到293細胞，螢光OK(24hr有50%)
3.抽RNA，濃度OK
4.RT-PCR
5.QPCR
但是QPCR的結果: CT值感覺沒有什麼變化
看不出K.D.的效果
請問大家有沒有遇過類似問題~或是有什麼好的解決方式~
謝謝大家~
P.S.shRNA序列是參考ABI公司的序列
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◆ From: 123.195.162.84
1F：推 huuban:RT-PCR有看出差異嗎？ 08/16 01:12
2F：推 ljii:這可能性太多了,扣除技術性問題,最可能的就是這個shRNA不work 08/16 02:13
3F：→ ljii:一般都是作好幾個shRNA看哪個work,效果最好 08/16 02:13
4F：→ ljii:比較保險的作法是找paper有證實的shRNA來用 08/16 02:14
5F：→ ljii:如果是照著一般guideline來設計, 就要多作幾個 08/16 02:15
6F：→ supray:通常1個target會設計約5個shRNA去試 08/16 08:08
7F：→ jordan01405:RT-PCR沒什麼差異 08/16 20:43
8F：→ jordan01405:我一個target設計3個~總共有2個target~可是兩個都沒有 08/16 20:44
9F：→ jordan01405:看出Knockdown的效果 08/16 20:44
10F：→ jordan01405:還是有可能他們都不Work~還在想是要重新transfect 08/16 20:45
11F：→ jordan01405:還是應該要重新再設計shRNA 08/16 20:46
12F：→ jordan01405:我選的序列是abi公司做過的~他們也做過可以成功 08/16 20:47
13F：→ jordan01405:所以兩個還是太少嗎? 08/16 20:50
14F：→ jordan01405:謝謝你們的回應~ 08/16 20:50
15F：→ puec2:你現在還會覺得shRNA比較省嗎? :) 08/16 20:55
16F：→ blence:如果序列是自己接的，很可能是銜接的設計不對 08/17 01:16
17F：推 galectin:同樣的序列在不同細胞上的效果會不相同 08/17 20:17
18F：→ galectin:可以嘗試RNAicore的shRNA，個人覺的非常省又好用 08/17 20:18
19F：推 jsi:順帶請教一下，若RNA有Knockdown但protein level沒差異，通常 08/19 23:54
20F：→ jsi:會再做那些測試呢? 還是逕行使用其他shRNA? 08/19 23:54
21F：→ xxtomnyxx:你 transfect 後多久做 cell lysis? 08/21 13:56
22F：→ xxtomnyxx:Protein 如果半衰期比較長，就算 RNA 減少了還是能再 08/21 13:57
23F：→ xxtomnyxx:細胞中持續存在一段時間。 08/21 13:57
24F：推 jsi:三天72h。如果是半衰期長的protein，用RNAi knockdown的方法要 08/21 22:16
25F：→ jsi:探討後續功能變化是否不可行? 有甚麼管道可以搜尋是否為半衰期 08/21 22:18
26F：→ jsi:長的protein嗎? 08/21 22:18