作者jordan01405 (空)
看板Biotech
标题[求救] 关於shRNA knockdown效果
时间Thu Aug 15 23:52:01 2013
大家好，小弟我最近实验遇到些问题
我用shRNA 去knockdown，前面的涂盘养菌都OK
1.抽plasmid，浓度和定序OK
2.transfect到293细胞，萤光OK(24hr有50%)
3.抽RNA，浓度OK
4.RT-PCR
5.QPCR
但是QPCR的结果: CT值感觉没有什麽变化
看不出K.D.的效果
请问大家有没有遇过类似问题~或是有什麽好的解决方式~
谢谢大家~
P.S.shRNA序列是参考ABI公司的序列
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◆ From: 123.195.162.84
1F：推 huuban:RT-PCR有看出差异吗？ 08/16 01:12
2F：推 ljii:这可能性太多了,扣除技术性问题,最可能的就是这个shRNA不work 08/16 02:13
3F：→ ljii:一般都是作好几个shRNA看哪个work,效果最好 08/16 02:13
4F：→ ljii:比较保险的作法是找paper有证实的shRNA来用 08/16 02:14
5F：→ ljii:如果是照着一般guideline来设计, 就要多作几个 08/16 02:15
6F：→ supray:通常1个target会设计约5个shRNA去试 08/16 08:08
7F：→ jordan01405:RT-PCR没什麽差异 08/16 20:43
8F：→ jordan01405:我一个target设计3个~总共有2个target~可是两个都没有 08/16 20:44
9F：→ jordan01405:看出Knockdown的效果 08/16 20:44
10F：→ jordan01405:还是有可能他们都不Work~还在想是要重新transfect 08/16 20:45
11F：→ jordan01405:还是应该要重新再设计shRNA 08/16 20:46
12F：→ jordan01405:我选的序列是abi公司做过的~他们也做过可以成功 08/16 20:47
13F：→ jordan01405:所以两个还是太少吗? 08/16 20:50
14F：→ jordan01405:谢谢你们的回应~ 08/16 20:50
15F：→ puec2:你现在还会觉得shRNA比较省吗? :) 08/16 20:55
16F：→ blence:如果序列是自己接的，很可能是衔接的设计不对 08/17 01:16
17F：推 galectin:同样的序列在不同细胞上的效果会不相同 08/17 20:17
18F：→ galectin:可以尝试RNAicore的shRNA，个人觉的非常省又好用 08/17 20:18
19F：推 jsi:顺带请教一下，若RNA有Knockdown但protein level没差异，通常 08/19 23:54
20F：→ jsi:会再做那些测试呢? 还是迳行使用其他shRNA? 08/19 23:54
21F：→ xxtomnyxx:你 transfect 後多久做 cell lysis? 08/21 13:56
22F：→ xxtomnyxx:Protein 如果半衰期比较长，就算 RNA 减少了还是能再 08/21 13:57
23F：→ xxtomnyxx:细胞中持续存在一段时间。 08/21 13:57
24F：推 jsi:三天72h。如果是半衰期长的protein，用RNAi knockdown的方法要 08/21 22:16
25F：→ jsi:探讨後续功能变化是否不可行? 有甚麽管道可以搜寻是否为半衰期 08/21 22:18
26F：→ jsi:长的protein吗? 08/21 22:18