※ 引述《naruto200420 (賤仔翔)》之銘言： : 每次做real-time PCR，做四重複，結果Ct會產生兩兩分群的現象，也就是數值兩個兩個 : : 相近，造成取值非常的困擾，但是melting curve卻是很有專一性的，之前懷疑是pipet error的 : : 現象，所以嘗試放大體積來加cDNA，可是結果沒有甚麼差異!?請問有板上的大大有有類 : : 似的經驗嗎? : : 另外加試劑的順序，氣泡存在與否，是不是會造成影響呢? : : 我的順序為先加水、sybrgreen、Primer混合成一管mix，分別加入8聯排，再加入 : : cDNA，希望大家可以幫幫我啊QQ : : -- :

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) : ◆ From: 140.112.4.209 : → roy047:氣泡在一開始加熱時就會破光了吧? 08/07 11:33 : → roy047:順序的話通常是體積大(水)先加, 原po寫的應該沒什麼問題 08/07 11:35 : → untilnow:換一排做 可能某幾個孔加熱有問題 08/07 11:43 : → naruto200420:那pipet要到第二段嗎,感覺sybrgreen mix 都會殘留 08/07 12:03 : → huuban:我去的實驗室是不用8連排的.. 08/07 14:13 : → ai760721:我都不用第二段 我覺得第二段出來有時候會黏在tip上 08/07 14:14 : → naruto200420:不推第二段,ct會跟之前的data有所差異吧,是mix還是cD 08/07 14:23 : → naruto200420:NA不推二段 08/07 14:23 : 推 mesenchymal:我的話會水跟cDNA mix在同一管,primer跟SybrGreen 08/07 23:29 : → mesenchymal:一管,不過我的問題是你這現象實驗室其他人也有嗎? 08/07 23:32 : → jsi:數值兩群差距有多大? 如果方法對，做三重覆即可，偶數組重覆 08/07 23:32 : → jsi:有點自找麻煩哪... 08/07 23:33 : → mesenchymal:如果其他人也有, 我懷疑是機器或tube的問題 08/07 23:34 : → naruto200420:如果cDNA降解會這樣嗎? 08/08 00:46 : → naruto200420:其他人也有Q_Q 08/08 00:46 : → naruto200420:兩組ct大約差0.7-1.5 08/08 11:31 ct差1其實就有點多了, 這表示RNA 量差了2倍左右, 如果你RNA是要看2-3倍的fold change那error會超大. 但如果是那種100 fold之類的 差異就還好 melting curve是看你的primer有沒有亂anneal melting curve正常還是不能排除你在pipette的variation 聽起來最有可能的還是pipette的誤差 我自己的經驗是我們lab習慣是18ul的master mix加2ul的sample master mix在加之前要vortex足夠, 之後每個well 加18ul的動作, 不要換tip, 推pipette盡可能等速而且不要太快 (太快會有部份殘留在tip), 我自己是會推第二段, 重點是要看到tip全空 同一個master mix的所有well用同一個tip, 然後tip盡一切可能每次都排空 加sample時也是要先vortex足夠然後慢慢加. 一開始學RT-PCR時會怕taq開始nonspecific 所以想盡快, 但後來發現這是杞人憂天, 只要你的plate在冰上, 幾乎不會有問題. 所以不如穩穩的確認每次master mix跟sample都排空. RT-PCR因為太sensitive所以一點點小差異一被放大就差很多 所以盡可能在加每個動作時都龜毛到極點, 有些定性的實驗像PCR, 其實你buffer啊水啊差個0.1ul其實根本沒差, 但RT-PCR就是要斤斤計較, 我甚至後來setup plate時都不聽音樂, 而且要在人最清醒時作, 狀況不好時容易出錯 因為我們lab看的東西常常是3-5個fold的差異而已, Ct差超過0.5就很可能不能相信了. --

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