※ 引述《naruto200420 (贱仔翔)》之铭言： : 每次做real-time PCR，做四重复，结果Ct会产生两两分群的现象，也就是数值两个两个 : : 相近，造成取值非常的困扰，但是melting curve却是很有专一性的，之前怀疑是pipet error的 : : 现象，所以尝试放大体积来加cDNA，可是结果没有甚麽差异!?请问有板上的大大有有类 : : 似的经验吗? : : 另外加试剂的顺序，气泡存在与否，是不是会造成影响呢? : : 我的顺序为先加水、sybrgreen、Primer混合成一管mix，分别加入8联排，再加入 : : cDNA，希望大家可以帮帮我啊QQ : : -- :

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) : ◆ From: 140.112.4.209 : → roy047:气泡在一开始加热时就会破光了吧? 08/07 11:33 : → roy047:顺序的话通常是体积大(水)先加, 原po写的应该没什麽问题 08/07 11:35 : → untilnow:换一排做 可能某几个孔加热有问题 08/07 11:43 : → naruto200420:那pipet要到第二段吗,感觉sybrgreen mix 都会残留 08/07 12:03 : → huuban:我去的实验室是不用8连排的.. 08/07 14:13 : → ai760721:我都不用第二段 我觉得第二段出来有时候会黏在tip上 08/07 14:14 : → naruto200420:不推第二段,ct会跟之前的data有所差异吧,是mix还是cD 08/07 14:23 : → naruto200420:NA不推二段 08/07 14:23 : 推 mesenchymal:我的话会水跟cDNA mix在同一管,primer跟SybrGreen 08/07 23:29 : → mesenchymal:一管,不过我的问题是你这现象实验室其他人也有吗? 08/07 23:32 : → jsi:数值两群差距有多大? 如果方法对，做三重覆即可，偶数组重覆 08/07 23:32 : → jsi:有点自找麻烦哪... 08/07 23:33 : → mesenchymal:如果其他人也有, 我怀疑是机器或tube的问题 08/07 23:34 : → naruto200420:如果cDNA降解会这样吗? 08/08 00:46 : → naruto200420:其他人也有Q_Q 08/08 00:46 : → naruto200420:两组ct大约差0.7-1.5 08/08 11:31 ct差1其实就有点多了, 这表示RNA 量差了2倍左右, 如果你RNA是要看2-3倍的fold change那error会超大. 但如果是那种100 fold之类的 差异就还好 melting curve是看你的primer有没有乱anneal melting curve正常还是不能排除你在pipette的variation 听起来最有可能的还是pipette的误差 我自己的经验是我们lab习惯是18ul的master mix加2ul的sample master mix在加之前要vortex足够, 之後每个well 加18ul的动作, 不要换tip, 推pipette尽可能等速而且不要太快 (太快会有部份残留在tip), 我自己是会推第二段, 重点是要看到tip全空 同一个master mix的所有well用同一个tip, 然後tip尽一切可能每次都排空 加sample时也是要先vortex足够然後慢慢加. 一开始学RT-PCR时会怕taq开始nonspecific 所以想尽快, 但後来发现这是杞人忧天, 只要你的plate在冰上, 几乎不会有问题. 所以不如稳稳的确认每次master mix跟sample都排空. RT-PCR因为太sensitive所以一点点小差异一被放大就差很多 所以尽可能在加每个动作时都龟毛到极点, 有些定性的实验像PCR, 其实你buffer啊水啊差个0.1ul其实根本没差, 但RT-PCR就是要斤斤计较, 我甚至後来setup plate时都不听音乐, 而且要在人最清醒时作, 状况不好时容易出错 因为我们lab看的东西常常是3-5个fold的差异而已, Ct差超过0.5就很可能不能相信了. --

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