作者naruto200420 (賤仔翔)
看板Biotech
標題[求救] real-time PCR Ct值疑問
時間Wed Aug 7 11:17:40 2013
發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
以方便板友幫您追蹤問題
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每次做real-time PCR，做四重複，結果Ct會產生兩兩分群的現象，也就是數值兩個兩個
相近，造成取值非常的困擾，但是melting curve卻是很有專一性的，之前懷疑是pipet error的
現象，所以嘗試放大體積來加cDNA，可是結果沒有甚麼差異!?請問有板上的大大有有類
似的經驗嗎?
另外加試劑的順序，氣泡存在與否，是不是會造成影響呢?
我的順序為先加水、sybrgreen、Primer混合成一管mix，分別加入8聯排，再加入
cDNA，希望大家可以幫幫我啊QQ
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◆ From: 140.112.4.209
1F：→ roy047:氣泡在一開始加熱時就會破光了吧? 08/07 11:33
2F：→ roy047:順序的話通常是體積大(水)先加, 原po寫的應該沒什麼問題 08/07 11:35
3F：→ untilnow:換一排做 可能某幾個孔加熱有問題 08/07 11:43
4F：→ naruto200420:那pipet要到第二段嗎,感覺sybrgreen mix 都會殘留 08/07 12:03
5F：→ huuban:我去的實驗室是不用8連排的.. 08/07 14:13
6F：→ ai760721:我都不用第二段 我覺得第二段出來有時候會黏在tip上 08/07 14:14
7F：→ naruto200420:不推第二段,ct會跟之前的data有所差異吧,是mix還是cD 08/07 14:23
8F：→ naruto200420:NA不推二段 08/07 14:23
9F：推 mesenchymal:我的話會水跟cDNA mix在同一管,primer跟SybrGreen 08/07 23:29
10F：→ mesenchymal:一管,不過我的問題是你這現象實驗室其他人也有嗎? 08/07 23:32
11F：→ jsi:數值兩群差距有多大? 如果方法對，做三重覆即可，偶數組重覆 08/07 23:32
12F：→ jsi:有點自找麻煩哪... 08/07 23:33
13F：→ mesenchymal:如果其他人也有, 我懷疑是機器或tube的問題 08/07 23:34
14F：→ naruto200420:如果cDNA降解會這樣嗎? 08/08 00:46
15F：→ naruto200420:其他人也有Q_Q 08/08 00:46
16F：→ naruto200420:兩組ct大約差0.7-1.5 08/08 11:31