作者naruto200420 (贱仔翔)
看板Biotech
标题[求救] real-time PCR Ct值疑问
时间Wed Aug 7 11:17:40 2013
发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出
以方便板友帮您追踪问题
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每次做real-time PCR，做四重复，结果Ct会产生两两分群的现象，也就是数值两个两个
相近，造成取值非常的困扰，但是melting curve却是很有专一性的，之前怀疑是pipet error的
现象，所以尝试放大体积来加cDNA，可是结果没有甚麽差异!?请问有板上的大大有有类
似的经验吗?
另外加试剂的顺序，气泡存在与否，是不是会造成影响呢?
我的顺序为先加水、sybrgreen、Primer混合成一管mix，分别加入8联排，再加入
cDNA，希望大家可以帮帮我啊QQ
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.4.209
1F：→ roy047:气泡在一开始加热时就会破光了吧? 08/07 11:33
2F：→ roy047:顺序的话通常是体积大(水)先加, 原po写的应该没什麽问题 08/07 11:35
3F：→ untilnow:换一排做 可能某几个孔加热有问题 08/07 11:43
4F：→ naruto200420:那pipet要到第二段吗,感觉sybrgreen mix 都会残留 08/07 12:03
5F：→ huuban:我去的实验室是不用8连排的.. 08/07 14:13
6F：→ ai760721:我都不用第二段 我觉得第二段出来有时候会黏在tip上 08/07 14:14
7F：→ naruto200420:不推第二段,ct会跟之前的data有所差异吧,是mix还是cD 08/07 14:23
8F：→ naruto200420:NA不推二段 08/07 14:23
9F：推 mesenchymal:我的话会水跟cDNA mix在同一管,primer跟SybrGreen 08/07 23:29
10F：→ mesenchymal:一管,不过我的问题是你这现象实验室其他人也有吗? 08/07 23:32
11F：→ jsi:数值两群差距有多大? 如果方法对，做三重覆即可，偶数组重覆 08/07 23:32
12F：→ jsi:有点自找麻烦哪... 08/07 23:33
13F：→ mesenchymal:如果其他人也有, 我怀疑是机器或tube的问题 08/07 23:34
14F：→ naruto200420:如果cDNA降解会这样吗? 08/08 00:46
15F：→ naruto200420:其他人也有Q_Q 08/08 00:46
16F：→ naruto200420:两组ct大约差0.7-1.5 08/08 11:31