作者TWX5566183 (塵世中一個迷途小五六)
看板Biotech
標題[求救] 關於colony PCR之問題
時間Tue Aug 6 18:06:31 2013
如題 要把A plasmid上的基因片段 接到 B plasmid上頭
A B兩種plasmid上都有CMV promoter
基因片段(A plasmid)為2K
Vector(B plasmid)為8K
原PO的實驗步驟如下
1.restriction enzyme digestion
使用XbaI 和 NheI兩個酵素同時作用 overnight 切Vector和 insert
因為XbaI 和 NheI的切位可以互相接起來 所以我使用了CIP處理Vector
2.Ligation
隔天將DNA片段經由gel extration後ligation 接著塗盤養overnight
以1:3 molar ratio Ligation
3.colony PCR
隔天長出菌落之後做colony PCR
以CMV primer作為forword
以基因上有的序列設計primer作為reverse
因為不管在A plasmid上還是我的新construct都是以CMV poromoter接著我的目標基因
所以我以A plasmid作為 positive control 大約300bp
但我的新construct卻P出一堆雜band 與positive control不符
挑了大概六十顆 結果完全相同
無法解釋這個現象 跪請版上強者幫忙
謝謝...
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.40.39
1F：→ blence:挑60顆,我覺得一個construct挑超過6顆,重做比較快 08/06 20:19
2F：→ blence:8k,應該是viral vector吧,如果是,看colony大小就能先排除了 08/06 20:22
3F：推 mesenchymal:有做vector only control嗎? 08/06 21:57
4F：→ jazzdevil:CIP處理需要改進，做不好容易這種結果 08/06 22:53
5F：推 puec2:一樓專業 08/08 10:10
6F：→ puec2:另外雜band多 可以調高annealing temperature試試 08/08 10:12
7F：推 ararthur:請問viral vector 的colony是會比較小嗎? but why? 08/14 11:35