作者TWX5566183 (尘世中一个迷途小五六)
看板Biotech
标题[求救] 关於colony PCR之问题
时间Tue Aug 6 18:06:31 2013
如题 要把A plasmid上的基因片段 接到 B plasmid上头
A B两种plasmid上都有CMV promoter
基因片段(A plasmid)为2K
Vector(B plasmid)为8K
原PO的实验步骤如下
1.restriction enzyme digestion
使用XbaI 和 NheI两个酵素同时作用 overnight 切Vector和 insert
因为XbaI 和 NheI的切位可以互相接起来 所以我使用了CIP处理Vector
2.Ligation
隔天将DNA片段经由gel extration後ligation 接着涂盘养overnight
以1:3 molar ratio Ligation
3.colony PCR
隔天长出菌落之後做colony PCR
以CMV primer作为forword
以基因上有的序列设计primer作为reverse
因为不管在A plasmid上还是我的新construct都是以CMV poromoter接着我的目标基因
所以我以A plasmid作为 positive control 大约300bp
但我的新construct却P出一堆杂band 与positive control不符
挑了大概六十颗 结果完全相同
无法解释这个现象 跪请版上强者帮忙
谢谢...
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.40.39
1F：→ blence:挑60颗,我觉得一个construct挑超过6颗,重做比较快 08/06 20:19
2F：→ blence:8k,应该是viral vector吧,如果是,看colony大小就能先排除了 08/06 20:22
3F：推 mesenchymal:有做vector only control吗? 08/06 21:57
4F：→ jazzdevil:CIP处理需要改进，做不好容易这种结果 08/06 22:53
5F：推 puec2:一楼专业 08/08 10:10
6F：→ puec2:另外杂band多 可以调高annealing temperature试试 08/08 10:12
7F：推 ararthur:请问viral vector 的colony是会比较小吗? but why? 08/14 11:35