作者puec2 ( .＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿.)
看板Biotech
標題Re: [求救] gel extraction
時間Fri Jul 26 16:54:08 2013
※ 引述《TWX5566183 (塵世中一個迷途小五六)》之銘言：
: 收完前一天用enzyme切的vector之後拿去跑膠 band非常亮
: (約8k多)
: 接著再把膠切下來拿去做gel extraction
: 收完之後取dna跑膠發現band不見了
: 想問問其可能的原因為何...謝謝
又一個受害者 先拍拍
這個主要的原因有兩點 也可以說一點
1. 你用的RE在gel extraction buffer裡面會degrade你的DNA.
2. 你切的gel比較大塊 在gel extraction buffer裡面溶比較久
(或者你跑去戰酸民 :p)所以degrade得很徹底
我會知道是因為我之前也一直為這個問題所困擾 有一次我用兩組
不同的RE切, 假設 A+B & C+D 好了 其中C+D我一直回收產量很低
我發現一樣的方法做下來 A+B這組回收的量比C+D高非常多!
如果你跟我一樣不能換RE, 我的解決方法是盡量把gel切小塊一點
, 比如說一大塊切成兩三塊小塊的 盡量減少溶gel的時間 人在旁邊
監控 不要等到全溶 溶到剩下一點點像米粒大小 就可以先拿出來放涼
等到全溶了 溫度也降得差不多 就可以直接過column純化
希望可以幫到忙 :)
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 211.76.175.170
1F：推 leoblack:1.RE在跑膠時還會卡在gel上?!不太合理喔 07/26 17:32
2F：→ leoblack:我倒是覺得是否是column的membrane壞了~ 07/26 17:32
※ 編輯: puec2 來自: 211.76.175.170 (07/26 17:58)
3F：→ puec2:RE黏在DNA上是比例問題 不是全有全無 07/26 17:59
4F：推 leoblack:我比較好奇的是~哪家的RE的Exonuclease活性這麼強~ 07/26 18:29
5F：→ leoblack:可以在gel elute時把band切的如此徹底乾淨到沒band 07/26 18:30
6F：→ leoblack:這麼強的活性在反應時不把DNA切光,卻靠殘留量把band切光 07/26 18:35
7F：→ blence:我不覺得是degrade,而是大塊gel跟elute後小量test視覺差異 07/26 19:38
8F：→ puec2:真的是degrade 跑電泳check我還可以看到degradation拖的尾巴 07/26 20:33
9F：→ puec2:至於活性 如果你用傳統方法抽過植物genomic DNA 07/26 20:34
10F：→ puec2:你應該會知道有某些nuclease就算你用phenol/chloroform/IAA 07/26 20:34
11F：→ puec2:洗過N次 就算你用超高速離心 然後再過butanol洗N次 07/26 20:35
12F：→ puec2:nuclease還是在那 你溫度一到就把DNA degrade給你看 07/26 20:36
13F：→ puec2:另外RE的活性就是這麼強阿 現在不是有 5min RE在賣嗎 07/26 20:38
14F：→ xxtomnyxx:應該是說哪家的 RE star activity 這麼強吧... 07/26 20:57
15F：→ puec2:我就說吧，是可以切很快的SphI 我沒有說哪一家喔 :) 07/26 21:20
16F：→ puec2:我猜啦 我改用SacI/BamHI就沒事 一放SphI 稍微放久一點 07/26 21:21
17F：→ puec2:就degrade惹 07/26 21:22
18F：→ xxtomnyxx:某家有做 SphI-HF，如果非用 SphI 不可的話，可以試試 07/26 21:53
19F：→ xxtomnyxx:價格一樣，不過我沒有用過，搞不好這就是原苦主用的也說 07/26 21:53
20F：→ xxtomnyxx:不定wwwwww 07/26 21:53
21F：→ puec2:不要咒我!!!我以為我不用再碰那個東西了!! 07/26 22:01
22F：→ leoblack:pu大,我覺得是SphI使用的buf剛好使得conta的nuclease好切 07/27 00:36
23F：→ leoblack:所以才會degrade,至少我用過SphI沒你講得這麼誇張 07/27 00:37
24F：推 ad1980:FastDigest 的 EcoRI 切半個小時以上就有 star activity 07/27 23:23
25F：→ jsi:我會先去跟別人借沒問題的gel extraction kit做做看，還有問題 07/28 23:47
26F：→ jsi:再去查原因。 07/28 23:48
27F：推 ararthur:我也不覺得是degrade 8K試著把elution buf 加熱到80度再 07/30 10:21
28F：→ ararthur:elute吧 不過puec2遇到的應該真的是degrade 有tail的話 07/30 10:23
29F：→ ararthur:另外*activity應該比較不會出現tail 而是出現雜band 因為 07/30 10:24
30F：→ ararthur:*act 該是Enz的specificity下降認錯mer的緣故 而不是什麼 07/30 10:25
31F：→ ararthur:DNA substrate都會切 07/30 10:26
32F：推 ararthur:我還想問問樓上上問的FastDig EcoRI 半小時以上有*act的 07/30 10:28
33F：→ ararthur:是哪一家?? 我要避開 EcoRI是我的幸運cut site XDD 07/30 10:29