作者puec2 ( .＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿.)
看板Biotech
标题Re: [求救] gel extraction
时间Fri Jul 26 16:54:08 2013
※ 引述《TWX5566183 (尘世中一个迷途小五六)》之铭言：
: 收完前一天用enzyme切的vector之後拿去跑胶 band非常亮
: (约8k多)
: 接着再把胶切下来拿去做gel extraction
: 收完之後取dna跑胶发现band不见了
: 想问问其可能的原因为何...谢谢
又一个受害者 先拍拍
这个主要的原因有两点 也可以说一点
1. 你用的RE在gel extraction buffer里面会degrade你的DNA.
2. 你切的gel比较大块 在gel extraction buffer里面溶比较久
(或者你跑去战酸民 :p)所以degrade得很彻底
我会知道是因为我之前也一直为这个问题所困扰 有一次我用两组
不同的RE切, 假设 A+B & C+D 好了 其中C+D我一直回收产量很低
我发现一样的方法做下来 A+B这组回收的量比C+D高非常多!
如果你跟我一样不能换RE, 我的解决方法是尽量把gel切小块一点
, 比如说一大块切成两三块小块的 尽量减少溶gel的时间 人在旁边
监控 不要等到全溶 溶到剩下一点点像米粒大小 就可以先拿出来放凉
等到全溶了 温度也降得差不多 就可以直接过column纯化
希望可以帮到忙 :)
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 211.76.175.170
1F：推 leoblack:1.RE在跑胶时还会卡在gel上?!不太合理喔 07/26 17:32
2F：→ leoblack:我倒是觉得是否是column的membrane坏了~ 07/26 17:32
※ 编辑: puec2 来自: 211.76.175.170 (07/26 17:58)
3F：→ puec2:RE黏在DNA上是比例问题 不是全有全无 07/26 17:59
4F：推 leoblack:我比较好奇的是~哪家的RE的Exonuclease活性这麽强~ 07/26 18:29
5F：→ leoblack:可以在gel elute时把band切的如此彻底乾净到没band 07/26 18:30
6F：→ leoblack:这麽强的活性在反应时不把DNA切光,却靠残留量把band切光 07/26 18:35
7F：→ blence:我不觉得是degrade,而是大块gel跟elute後小量test视觉差异 07/26 19:38
8F：→ puec2:真的是degrade 跑电泳check我还可以看到degradation拖的尾巴 07/26 20:33
9F：→ puec2:至於活性 如果你用传统方法抽过植物genomic DNA 07/26 20:34
10F：→ puec2:你应该会知道有某些nuclease就算你用phenol/chloroform/IAA 07/26 20:34
11F：→ puec2:洗过N次 就算你用超高速离心 然後再过butanol洗N次 07/26 20:35
12F：→ puec2:nuclease还是在那 你温度一到就把DNA degrade给你看 07/26 20:36
13F：→ puec2:另外RE的活性就是这麽强阿 现在不是有 5min RE在卖吗 07/26 20:38
14F：→ xxtomnyxx:应该是说哪家的 RE star activity 这麽强吧... 07/26 20:57
15F：→ puec2:我就说吧，是可以切很快的SphI 我没有说哪一家喔 :) 07/26 21:20
16F：→ puec2:我猜啦 我改用SacI/BamHI就没事 一放SphI 稍微放久一点 07/26 21:21
17F：→ puec2:就degrade惹 07/26 21:22
18F：→ xxtomnyxx:某家有做 SphI-HF，如果非用 SphI 不可的话，可以试试 07/26 21:53
19F：→ xxtomnyxx:价格一样，不过我没有用过，搞不好这就是原苦主用的也说 07/26 21:53
20F：→ xxtomnyxx:不定wwwwww 07/26 21:53
21F：→ puec2:不要咒我!!!我以为我不用再碰那个东西了!! 07/26 22:01
22F：→ leoblack:pu大,我觉得是SphI使用的buf刚好使得conta的nuclease好切 07/27 00:36
23F：→ leoblack:所以才会degrade,至少我用过SphI没你讲得这麽夸张 07/27 00:37
24F：推 ad1980:FastDigest 的 EcoRI 切半个小时以上就有 star activity 07/27 23:23
25F：→ jsi:我会先去跟别人借没问题的gel extraction kit做做看，还有问题 07/28 23:47
26F：→ jsi:再去查原因。 07/28 23:48
27F：推 ararthur:我也不觉得是degrade 8K试着把elution buf 加热到80度再 07/30 10:21
28F：→ ararthur:elute吧 不过puec2遇到的应该真的是degrade 有tail的话 07/30 10:23
29F：→ ararthur:另外*activity应该比较不会出现tail 而是出现杂band 因为 07/30 10:24
30F：→ ararthur:*act 该是Enz的specificity下降认错mer的缘故 而不是什麽 07/30 10:25
31F：→ ararthur:DNA substrate都会切 07/30 10:26
32F：推 ararthur:我还想问问楼上上问的FastDig EcoRI 半小时以上有*act的 07/30 10:28
33F：→ ararthur:是哪一家?? 我要避开 EcoRI是我的幸运cut site XDD 07/30 10:29