關於做ubi的IP 我的方法很不一樣(不過是學弟先try過 是work的) lysate的收取 沒有甚麼問題 需要注意的IP的步驟 P.S 忘了說 收細胞的時候我知道你想要讓lysate濃一點 但是一盤10cm dish用100ul收 有點太少了 (我想至少要200-300ul)其實很濃的話 lysis的效果不一定好 也就是說 真正融出protein的量(或說效率)並不多 在離心的時候 搞不好很多沒破的細胞在 pellet裡 我的建議是buffer多一點 或是lysis的時候 過26號針頭(破的效率更好) 這樣亦可 參考看看 1.beads(就是你說的磁珠 我是用proteinG or A beads) wash與否就我的經驗應該影響不大(洗或不洗沒差) 2.lysate的量有點少 像我是不測濃度(偷懶 haha 但是特殊的實驗還是要測的 欲知詳情 再問我) 我是會把體積補到1050ul 這是有原因的 50ul留下做為input (positive control) 剩下的各分500ul到兩管 一管是IP ubi-另一管是IgG (negtive control) 最後將兩管的體積用lysis buffer補到1000ul 然後加入抗體(我是不會把beads 和抗體一起混) 記得ubi-和IgG下的量要一致(control的一定要做好) 不然會有false positive的結果 最後在4度C rotation 1-2 hr 因為ubi-的訊號很快消失不要混太久 3.和抗體混完之後 每管(包含IgG組別也要)加入beads(磁珠)我會加30-40ul 一樣在4度C rotation至少1hr (延長至2-3hr也可以 視狀況調整)之後離心wash(一樣用lysis buffer)3-5次 每次加入500ul buffer 4.wash完後 移除上清液 加入1x sample buffer(loading buffer,與加入beads體積相同 30-40ul) vortex混勻即可 置於95度C 10 mins 然後loading跑SDS PAGE 記得 如果loading sample的量很多 上膠可跑慢一點(70-90V)這樣會跑得漂亮 下膠之後可以加速至120-140V ______________________________________________________________________________ 以上 希望有幫到你 加油啊 學弟 ※ 引述《cc1129 (西西智)》之銘言： : 板上各位先進好 : 本人最近在做免疫沉澱(IP)，目的是想看細胞內某蛋白ubiquitination的情形， : 但本人是免疫沉澱新手，有許多細節還不太清楚，目前操作步驟如下述， : 希望板上先進可以幫忙看看有沒有須改進的地方，最後面還有一些雞毛蒜皮的問題， : 也希望能為小弟一併解答..... : (小弟表達能力不太好，若看不太懂請見諒...) : -------------------------------------------------------------------------------------------- : Cell Lysate Preparation : RIPA (for cell lysis) : 150 mM NaCl 50 mM Tris-Cl (pH 7.4) : 1 mM EDTA 1.0% Nonidet P-40 (NP-40) : 0.1% SDS 0.5% Sodium deoxycholate : 使用前加Protease Inhibitor : 1. 以冰PBS wash dish 2次，傾斜plate將殘餘PBS移除乾淨， : 每10cm dish加 100 uL cold RIPA，冰上刮下到離心管， : 冰上靜置30分鐘，每5分鐘強力vortex 10秒。 : 2. 12,000 rpm離心15分鐘，4度C。 : 3. 取上清到新離心管置於冰上，測蛋白濃度，當日接著做IP。 : Immunoprecipitation : 1. 磁珠去除保存液，以 PBS+0.1% Tween 20 (後稱PBST) 洗2次， : 然後加入PBST待用(體積同取出磁珠液時的體積)。 : 2. 取 100-200 ug Lysate (體積 100 uL以內)，以RIPA補到 100 uL。 : 3. 加入 50 uL 磁珠，再補 100 uL PBST，至此IP反應總體積 250 uL。 : 4. 加入 1 ug Capture Ab，以parafilm封口，4度C下翻轉反應overnight。 : 5. 去除上清留下磁珠，以PBST wash 3次。 : Elution : 磁珠加入 40 uL 1X Loading Buffer，95度C下震盪10分鐘後， : 插冰上稍微冷卻後，立即將液體移到新管(約剩 30 uL 多一點點)。 : Western Blot : 每個sample load 30 uL : (因為此部分比較沒有疑慮，所以就不多加敘述了) : -------------------------------------------------------------------------------------------- : 另外，還有下面的問題想請教各位： : 1. 如果要排除protein-protein interaction，以RIPA收下lysate後， : 是否需要先95度C煮過再做IP? : 目前做的是都沒先煮過，RIPA看資料說是強力的lysis Buffer， : 內含的ionic detergent已可破壞protein-protein interaction， : 但是學長說要煮才對，不知道是不是我認知錯誤? : 可是也有人說不用煮。 : 雖然先煮過理論上是可以保證非共價的interaction會被破壞， : 但又怕太激烈ubiquitin的共價鍵會斷 (理論上是不會斷啦...實際上就不知道了)。 : 2. 若lysate有點黏稠(DNA釋出?)，是否可用sonication將其震過? : sonication會不會讓ubiquitin鍊斷裂? (共價的DNA分子都可以斷的話...) : 3. 我查網路上的資料，RIPA的環境下應該可直接進行Ab和target protein的binding， : 但還是怕裡面的SDS太強，所以用PBST稀釋了，不知道這樣可不可以? : 如果可以，能再用更多的PBST把RIPA稀釋嗎? 還是需要改用其他buffer? : 4. Pre-clear是否為IP必要步驟? : Pre-clear可再加IgG isotype去除樣本跟IgG的非特異性結合嗎? : 5. IP後的wash該如何操作較適當? : IP完之後的wash是否可以小力vortex懸浮磁珠， : 還是說只需用wash buffer將磁珠沖過就好? : 6. IP之後的wash是否可減少到2次? : 因為我要看的是target protein上面ubiquitination的程度， : 以前的朋友說看ubiquitination的話不能洗太多次。 : 7. Elution時是否需震盪? : 我最後要從磁珠上elute蛋白時會用 1,000 rpm 震盪讓磁珠在加熱時懸浮， : 想說讓elution比較完全，還是說根本完全沒必要震盪? : 8. 跑膠Loading Sample時可否將磁珠一起load進去? : 因為Elution後，雖然利用強力磁鐵分離磁珠， : 但是還會有大概 5 uL 的Sample會殘留在磁珠團中， : 不知道可不可以將磁珠一起load進去，減少Sample損失? : 9. 用light chain-specific secondary antibody (monoclonal) : 去認polyclonal rabbit primary antibody是否不需考慮認的light chain : 是lambda還是kappa型的? --

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