关於做ubi的IP 我的方法很不一样(不过是学弟先try过 是work的) lysate的收取 没有甚麽问题 需要注意的IP的步骤 P.S 忘了说 收细胞的时候我知道你想要让lysate浓一点 但是一盘10cm dish用100ul收 有点太少了 (我想至少要200-300ul)其实很浓的话 lysis的效果不一定好 也就是说 真正融出protein的量(或说效率)并不多 在离心的时候 搞不好很多没破的细胞在 pellet里 我的建议是buffer多一点 或是lysis的时候 过26号针头(破的效率更好) 这样亦可 参考看看 1.beads(就是你说的磁珠 我是用proteinG or A beads) wash与否就我的经验应该影响不大(洗或不洗没差) 2.lysate的量有点少 像我是不测浓度(偷懒 haha 但是特殊的实验还是要测的 欲知详情 再问我) 我是会把体积补到1050ul 这是有原因的 50ul留下做为input (positive control) 剩下的各分500ul到两管 一管是IP ubi-另一管是IgG (negtive control) 最後将两管的体积用lysis buffer补到1000ul 然後加入抗体(我是不会把beads 和抗体一起混) 记得ubi-和IgG下的量要一致(control的一定要做好) 不然会有false positive的结果 最後在4度C rotation 1-2 hr 因为ubi-的讯号很快消失不要混太久 3.和抗体混完之後 每管(包含IgG组别也要)加入beads(磁珠)我会加30-40ul 一样在4度C rotation至少1hr (延长至2-3hr也可以 视状况调整)之後离心wash(一样用lysis buffer)3-5次 每次加入500ul buffer 4.wash完後 移除上清液 加入1x sample buffer(loading buffer,与加入beads体积相同 30-40ul) vortex混匀即可 置於95度C 10 mins 然後loading跑SDS PAGE 记得 如果loading sample的量很多 上胶可跑慢一点(70-90V)这样会跑得漂亮 下胶之後可以加速至120-140V ______________________________________________________________________________ 以上 希望有帮到你 加油啊 学弟 ※ 引述《cc1129 (西西智)》之铭言： : 板上各位先进好 : 本人最近在做免疫沉淀(IP)，目的是想看细胞内某蛋白ubiquitination的情形， : 但本人是免疫沉淀新手，有许多细节还不太清楚，目前操作步骤如下述， : 希望板上先进可以帮忙看看有没有须改进的地方，最後面还有一些鸡毛蒜皮的问题， : 也希望能为小弟一并解答..... : (小弟表达能力不太好，若看不太懂请见谅...) : -------------------------------------------------------------------------------------------- : Cell Lysate Preparation : RIPA (for cell lysis) : 150 mM NaCl 50 mM Tris-Cl (pH 7.4) : 1 mM EDTA 1.0% Nonidet P-40 (NP-40) : 0.1% SDS 0.5% Sodium deoxycholate : 使用前加Protease Inhibitor : 1. 以冰PBS wash dish 2次，倾斜plate将残余PBS移除乾净， : 每10cm dish加 100 uL cold RIPA，冰上刮下到离心管， : 冰上静置30分钟，每5分钟强力vortex 10秒。 : 2. 12,000 rpm离心15分钟，4度C。 : 3. 取上清到新离心管置於冰上，测蛋白浓度，当日接着做IP。 : Immunoprecipitation : 1. 磁珠去除保存液，以 PBS+0.1% Tween 20 (後称PBST) 洗2次， : 然後加入PBST待用(体积同取出磁珠液时的体积)。 : 2. 取 100-200 ug Lysate (体积 100 uL以内)，以RIPA补到 100 uL。 : 3. 加入 50 uL 磁珠，再补 100 uL PBST，至此IP反应总体积 250 uL。 : 4. 加入 1 ug Capture Ab，以parafilm封口，4度C下翻转反应overnight。 : 5. 去除上清留下磁珠，以PBST wash 3次。 : Elution : 磁珠加入 40 uL 1X Loading Buffer，95度C下震荡10分钟後， : 插冰上稍微冷却後，立即将液体移到新管(约剩 30 uL 多一点点)。 : Western Blot : 每个sample load 30 uL : (因为此部分比较没有疑虑，所以就不多加叙述了) : -------------------------------------------------------------------------------------------- : 另外，还有下面的问题想请教各位： : 1. 如果要排除protein-protein interaction，以RIPA收下lysate後， : 是否需要先95度C煮过再做IP? : 目前做的是都没先煮过，RIPA看资料说是强力的lysis Buffer， : 内含的ionic detergent已可破坏protein-protein interaction， : 但是学长说要煮才对，不知道是不是我认知错误? : 可是也有人说不用煮。 : 虽然先煮过理论上是可以保证非共价的interaction会被破坏， : 但又怕太激烈ubiquitin的共价键会断 (理论上是不会断啦...实际上就不知道了)。 : 2. 若lysate有点黏稠(DNA释出?)，是否可用sonication将其震过? : sonication会不会让ubiquitin链断裂? (共价的DNA分子都可以断的话...) : 3. 我查网路上的资料，RIPA的环境下应该可直接进行Ab和target protein的binding， : 但还是怕里面的SDS太强，所以用PBST稀释了，不知道这样可不可以? : 如果可以，能再用更多的PBST把RIPA稀释吗? 还是需要改用其他buffer? : 4. Pre-clear是否为IP必要步骤? : Pre-clear可再加IgG isotype去除样本跟IgG的非特异性结合吗? : 5. IP後的wash该如何操作较适当? : IP完之後的wash是否可以小力vortex悬浮磁珠， : 还是说只需用wash buffer将磁珠冲过就好? : 6. IP之後的wash是否可减少到2次? : 因为我要看的是target protein上面ubiquitination的程度， : 以前的朋友说看ubiquitination的话不能洗太多次。 : 7. Elution时是否需震荡? : 我最後要从磁珠上elute蛋白时会用 1,000 rpm 震荡让磁珠在加热时悬浮， : 想说让elution比较完全，还是说根本完全没必要震荡? : 8. 跑胶Loading Sample时可否将磁珠一起load进去? : 因为Elution後，虽然利用强力磁铁分离磁珠， : 但是还会有大概 5 uL 的Sample会残留在磁珠团中， : 不知道可不可以将磁珠一起load进去，减少Sample损失? : 9. 用light chain-specific secondary antibody (monoclonal) : 去认polyclonal rabbit primary antibody是否不需考虑认的light chain : 是lambda还是kappa型的? --

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