作者A03692002200 (chen)
看板Biotech
標題[求救] 螢光染色實驗背景值
時間Thu Jul 11 01:32:46 2013
目前實驗是單純只做簡單的螢光實驗~
實驗目的是想將細胞經過光照之後導致細胞凋亡或者壞死
所以使用ANNEXIN V-FITC/PI 方式染色
但是老師希望先做螢光染色判定有沒有就好
實驗步驟是將細胞用 PBS 清洗過後，
先加ANNEXIN V-FITC 染劑 10 分鐘
用 Binding Buffer 清洗3次過後
再加 PI 染劑 5 分鐘
再清洗
然後加入 Binding Buffer 之後，就照螢光顯微鏡
但是目前照出來的結果
染劑都有激發出來，也有順利染上
但是背景值太高
如果將背景值調掉，會連我要拍的細胞都消失
但是將我要拍的細胞亮度調高的話，背景值又太亮
就是亮度不夠，但是我將曝光時間加長也是一樣
目前是排除沒有清洗乾淨~因為我都會清洗3次~並且用shaker慢慢晃
比較有可能的是激發波長不對(不過之前學長姐也是用該濾鏡激發，拍出來很成功)
另一個是染劑太少(染劑量是 97.5μL Binding Buffer+2.5μL ANNEXIN V-FITC 染劑)
除了重染以外，老師是說看能不能將背景值去掉
所以想請教各位，以螢光染色來說
有什麼軟體或方法，可以將已經拍好的圖片，去除背景值?
因為已經試過ImageJ 跟Photoshop了 都無法很漂亮的將背景值去掉
或者是否有做過這個實驗的人~可以給一點建議呢 > <
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 220.137.119.63
1F：→ apa9394:請問有圖嘛 能放個一張給版友看看嘛? 07/11 11:17
2F：→ apa9394:如果條件沒抓到 signal太弱 硬調是不好的 07/11 11:19
3F：→ vandia:這樣看起來..會不會是沒染上? 07/11 12:20
4F：→ formoxa:要考慮沒染上或是根本沒有 07/11 13:48
5F：推 oplz:如果只修改圖片的部份 (去除背景值) 就是改圖了 07/11 15:00
6F：推 mesenchymal:還是重染比較好，不然初步確認自己都半信半疑了 07/11 22:04
附上一張圖
http://ppt.cc/0LOc
這是只有 annexin V-FITC 的圖~
因為硬調就很假的感覺~我也不敢亂調~"~
目前看是有染上~因為就在細胞膜外面一圈
目前是打算用蛋白激酶先誘發細胞凋亡做一組負向控制組
AND~
有人建議在染完ANNEXIN V-FITC 之後，先不清洗，直接加入 PI 染色 5分鐘
之後在一起清洗~
就打算先做一組試試了~
※ 編輯: A03692002200 來自: 220.137.114.11 (07/13 02:49)
7F：→ vandia:喔喔 最後一次wash的時候用純的PBS試試看 (個人經驗) 07/13 10:35
8F：→ vandia:1X PBS 不要用PBST 07/13 10:35
為何要用 PBS?
※ 編輯: A03692002200 來自: 140.135.101.144 (07/13 15:09)