作者A03692002200 (chen)
看板Biotech
标题[求救] 萤光染色实验背景值
时间Thu Jul 11 01:32:46 2013
目前实验是单纯只做简单的萤光实验~
实验目的是想将细胞经过光照之後导致细胞凋亡或者坏死
所以使用ANNEXIN V-FITC/PI 方式染色
但是老师希望先做萤光染色判定有没有就好
实验步骤是将细胞用 PBS 清洗过後，
先加ANNEXIN V-FITC 染剂 10 分钟
用 Binding Buffer 清洗3次过後
再加 PI 染剂 5 分钟
再清洗
然後加入 Binding Buffer 之後，就照萤光显微镜
但是目前照出来的结果
染剂都有激发出来，也有顺利染上
但是背景值太高
如果将背景值调掉，会连我要拍的细胞都消失
但是将我要拍的细胞亮度调高的话，背景值又太亮
就是亮度不够，但是我将曝光时间加长也是一样
目前是排除没有清洗乾净~因为我都会清洗3次~并且用shaker慢慢晃
比较有可能的是激发波长不对(不过之前学长姐也是用该滤镜激发，拍出来很成功)
另一个是染剂太少(染剂量是 97.5μL Binding Buffer+2.5μL ANNEXIN V-FITC 染剂)
除了重染以外，老师是说看能不能将背景值去掉
所以想请教各位，以萤光染色来说
有什麽软体或方法，可以将已经拍好的图片，去除背景值?
因为已经试过ImageJ 跟Photoshop了 都无法很漂亮的将背景值去掉
或者是否有做过这个实验的人~可以给一点建议呢 > <
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 220.137.119.63
1F：→ apa9394:请问有图嘛 能放个一张给版友看看嘛? 07/11 11:17
2F：→ apa9394:如果条件没抓到 signal太弱 硬调是不好的 07/11 11:19
3F：→ vandia:这样看起来..会不会是没染上? 07/11 12:20
4F：→ formoxa:要考虑没染上或是根本没有 07/11 13:48
5F：推 oplz:如果只修改图片的部份 (去除背景值) 就是改图了 07/11 15:00
6F：推 mesenchymal:还是重染比较好，不然初步确认自己都半信半疑了 07/11 22:04
附上一张图
http://ppt.cc/0LOc
这是只有 annexin V-FITC 的图~
因为硬调就很假的感觉~我也不敢乱调~"~
目前看是有染上~因为就在细胞膜外面一圈
目前是打算用蛋白激酶先诱发细胞凋亡做一组负向控制组
AND~
有人建议在染完ANNEXIN V-FITC 之後，先不清洗，直接加入 PI 染色 5分钟
之後在一起清洗~
就打算先做一组试试了~
※ 编辑: A03692002200 来自: 220.137.114.11 (07/13 02:49)
7F：→ vandia:喔喔 最後一次wash的时候用纯的PBS试试看 (个人经验) 07/13 10:35
8F：→ vandia:1X PBS 不要用PBST 07/13 10:35
为何要用 PBS?
※ 编辑: A03692002200 来自: 140.135.101.144 (07/13 15:09)