作者garlic774 (蒜頭)
看板Biotech
標題[求救]mice lung 的 total Akt 不表現?
時間Wed Jul 3 22:52:27 2013
各位大大好~
我想看某藥物對primary cultre的Akt(total 或 phospho form)
然後拿mice 整顆 lung 當作 positive control
結果:
1. primay culture(有無加藥的組別)
的total Akt or p-Akt都非常弱(protein量: 20 ug/ lane)
2. total lung 的 total Akt or p-Akt也都非常弱(protein量: 20, 50 ug/ lane)
抗體Akt:santa cruz(host:Goat; dilute:1:1000)
抗體p-Akt:santa cruz(host:Rabbit;dilute:1:1000)
兩支抗體"理論上"都應該壓得出來且背景乾淨(因為抗體是跟同學借來的
他壓的很clean>"<)
但實際上不是.....
二抗: 1:5000
3. 壓片時間:5 min /1 image，連續4張
4. 所以問題A:total lung 適合拿來用作Akt/p-Akt的positive control嗎?
還是要用insulin/IGF刺激的cultured cell?
問題B:一般的total 器官 protein 不會有Akt 表現嗎?
問題C:p-Akt/total Akt可以染螢光嗎? 染螢光可以量化嗎?
問題D:還是其實我壓的是對的，lung tissue沒有 Akt表現
我的primary culture 加藥或不加藥也都沒表現
所以根本不是這條路徑?
感謝看完~
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.121.119
※ 編輯: garlic774 來自: 140.112.121.119 (07/03 22:54)
※ 編輯: garlic774 來自: 140.112.121.119 (07/03 22:54)
※ 編輯: garlic774 來自: 140.112.121.119 (07/03 22:58)
1F：推 mesenchymal:你應該拿一株AKT/p-AKT表現得都很強的cell line當 07/03 23:04
2F：→ mesenchymal:positive control 07/03 23:04
※ 編輯: garlic774 來自: 140.112.121.119 (07/03 23:30)
3F：推 keeny:推薦cell signaling 抗體(AKT & pAKT), 我博班論文靠它很多 07/08 15:26
4F：推 hsuwenli:你和你同學的blocking是同樣的嗎?如果是tissue 07/08 17:15
5F：→ hsuwenli:或許你可以試看看用BSA blocking 07/08 17:15
6F：→ hsuwenli:我發現很多人覺得好用的抗體,往往會因為blocking reagent 07/08 17:18
7F：→ hsuwenli:不同而出現兩極評價,或許你可以參考看看 07/08 17:19
8F：→ hsuwenli:pAKT或AKT細胞內一定有,所以一定壓得出來,只是表現量不同 07/08 17:22
9F：→ hsuwenli:不過你沒放圖,所以我無法幫你辨別問題在哪,我只是以我的 07/08 17:23
10F：→ hsuwenli:過往經驗回覆與你相似的問題 07/08 17:23
11F：→ garlic774:感謝K大和H大 內文我的blocking buffer 是用BSA沒錯 07/09 22:39