作者garlic774 (蒜头)
看板Biotech
标题[求救]mice lung 的 total Akt 不表现?
时间Wed Jul 3 22:52:27 2013
各位大大好~
我想看某药物对primary cultre的Akt(total 或 phospho form)
然後拿mice 整颗 lung 当作 positive control
结果:
1. primay culture(有无加药的组别)
的total Akt or p-Akt都非常弱(protein量: 20 ug/ lane)
2. total lung 的 total Akt or p-Akt也都非常弱(protein量: 20, 50 ug/ lane)
抗体Akt:santa cruz(host:Goat; dilute:1:1000)
抗体p-Akt:santa cruz(host:Rabbit;dilute:1:1000)
两支抗体"理论上"都应该压得出来且背景乾净(因为抗体是跟同学借来的
他压的很clean>"<)
但实际上不是.....
二抗: 1:5000
3. 压片时间:5 min /1 image，连续4张
4. 所以问题A:total lung 适合拿来用作Akt/p-Akt的positive control吗?
还是要用insulin/IGF刺激的cultured cell?
问题B:一般的total 器官 protein 不会有Akt 表现吗?
问题C:p-Akt/total Akt可以染萤光吗? 染萤光可以量化吗?
问题D:还是其实我压的是对的，lung tissue没有 Akt表现
我的primary culture 加药或不加药也都没表现
所以根本不是这条路径?
感谢看完~
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.121.119
※ 编辑: garlic774 来自: 140.112.121.119 (07/03 22:54)
※ 编辑: garlic774 来自: 140.112.121.119 (07/03 22:54)
※ 编辑: garlic774 来自: 140.112.121.119 (07/03 22:58)
1F：推 mesenchymal:你应该拿一株AKT/p-AKT表现得都很强的cell line当 07/03 23:04
2F：→ mesenchymal:positive control 07/03 23:04
※ 编辑: garlic774 来自: 140.112.121.119 (07/03 23:30)
3F：推 keeny:推荐cell signaling 抗体(AKT & pAKT), 我博班论文靠它很多 07/08 15:26
4F：推 hsuwenli:你和你同学的blocking是同样的吗?如果是tissue 07/08 17:15
5F：→ hsuwenli:或许你可以试看看用BSA blocking 07/08 17:15
6F：→ hsuwenli:我发现很多人觉得好用的抗体,往往会因为blocking reagent 07/08 17:18
7F：→ hsuwenli:不同而出现两极评价,或许你可以参考看看 07/08 17:19
8F：→ hsuwenli:pAKT或AKT细胞内一定有,所以一定压得出来,只是表现量不同 07/08 17:22
9F：→ hsuwenli:不过你没放图,所以我无法帮你辨别问题在哪,我只是以我的 07/08 17:23
10F：→ hsuwenli:过往经验回覆与你相似的问题 07/08 17:23
11F：→ garlic774:感谢K大和H大 内文我的blocking buffer 是用BSA没错 07/09 22:39