作者mary1017 (阿精)
看板Biotech
標題[求救] 配13公分大片膠的注膠問題
時間Sat Jun 15 00:56:09 2013
各位好:
因為整個系上只有我一個人做二維電泳
目前遇到一些問題,因此上來這裡請求幫助了!
請不吝指教 非常感謝^^
目前遇到的最大問題是 跑完第一維的13公分IEF後
要配大片的SDS-PAGE作第二維電泳
我使用的配方是 30%ACRYLAMINE 18.75ML
1.5M TRIS 9.375ML
DD WATER 9.375 ML
1% APS 375uL
TEMED 18.75%
就是含有15%的ACRYLAMINE的膠
配完後有充分的震盪均勻
再拿塑膠吸管去注膠 兩片玻璃片也先用95%酒精擦拭過了...
兩側的SPACER是比較厚的那種..
當我注完膠之後 馬上用異丙醇壓膠等待下膠凝固
問題就是:
膠的最上層的兩側角角應該要是直角形的!!
但我的膠凝固後 兩邊的角角都是往下凹的 呈圓弧狀@@
配了好幾次都會變成圓弧的角
這樣我放吸了MARKER的濾紙片都會往旁邊倒.歪歪的
跑出來的MARKER超級扭曲 好醜!
請問有甚麼技巧可以讓膠注的好? 可以有直角...
若是我減少APS的量 讓他凝固速度變慢,這樣可以改善嗎?
或是我壓膠的速度放慢呢?
謝謝耐心看完文章^^
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 61.227.242.49
1F：→ blence:這組成，你的gel配方跟一般的PAGE本來就不一樣嗎？APS好低 06/15 01:35
2F：→ roy047:兩邊往下凹表示底下會漏... 06/15 09:25
※ 編輯: mary1017 來自: 140.116.162.76 (06/15 19:08)
3F：→ vandia:充分震盪均勻 <== 這樣不會有小氣泡嘛? 06/15 21:14
4F：→ mary1017:上層會有泡泡 我都先從下層開始吸 最後配完會剩一些 06/15 21:35
5F：→ mary1017:但是我沒有漏膠的狀況... 06/15 21:36
6F：→ mary1017:之前配小片7公分的膠 漏膠時也是一起往下降的說 @@ 06/15 21:36
7F：推 kakaman:2D大片膠氣泡問題只要搖一搖敲一敲,氣泡就浮上來了 06/16 11:53
8F：→ kakaman:會不會是你上方的spacer跟玻璃的密合有差 06/16 11:55
9F：→ mary1017:兩側的夾?子 (可以轉緊的那種) 和玻璃片,spacer同樣長度 06/16 16:10
10F：→ mary1017:不過我把異丙醇掉到,換成running buffer時 會看到膠的上 06/16 16:10
11F：→ mary1017:層和玻璃片之間有氣泡出現 06/16 16:11
12F：→ mary1017:然後就會看到某邊的角陷下去變成圓弧形的了 @@ 06/16 16:12
13F：→ mary1017:還是改成從中間處加異丙醇呢? 之前都是由一側spacer緊貼 06/16 16:13
14F：→ mary1017:的加異丙醇壓膠,然後那側就會凹陷.... 06/16 16:13
15F：→ Invec:所有溶液有恢復到室溫再開始配嗎 06/16 18:08
16F：推 martyrtitan:震盪完要先抽氣，再加入APS和TEMED 06/16 21:37
17F：推 kakaman:我回想起以前作2D的慘痛日子了... 06/17 00:03
18F：→ kakaman:你跑一維是用strip嗎? 06/17 00:04
19F：→ kakaman:的確我以前在作很靠近邊邊,膠也會有點圓弧 06/17 00:06
20F：→ kakaman:但是我記得strip比膠還短的多 06/17 00:06
21F：→ kakaman:你可以先放水在放strip接著吸乾水,放maker 06/17 00:09
22F：→ kakaman:最後在倒agarose把他封起來 06/17 00:10
23F：→ kakaman:其實maker稍醜無所謂,重要的是你最後的蛋白點 06/17 00:11
24F：→ kakaman:所以你稍微調整一下maker,strip在膠上的位置,應該改善 06/17 00:13
25F：→ kakaman:我之前作Maker都擺得很正沒東倒西歪過 06/17 00:14
回KAKAMAN:我是用13公分的strip跑第一維..但strip兩端塑膠片剪掉後放到SDS PAGE上
的時後就只剩一點點的位子可以放濾紙了 @@
我是先把異丙醇倒掉..換成RUNNGING BUFFER 加到滿~接下來把STRIP放下去,
等它沉下去之後,再用針頭把BUFFER盡量吸乾
最後放濾紙
※ 編輯: mary1017 來自: 140.116.162.76 (06/17 18:07)
這次我有把配膠的溶液都放到常溫之下
並且改成從中間的部分去LOADING異丙醇... 膠凝固後,沒有之前出現的圓弧形角角了!
希望下次還可以作成功!
很謝謝大家的幫忙 ^^ 十分感謝!
※ 編輯: mary1017 來自: 140.116.162.76 (06/17 18:11)
※ 編輯: mary1017 來自: 140.116.162.76 (06/17 18:13)
26F：→ vandia:異丙醇倒掉有沒有先用二次水沖過啊? 06/17 22:10
27F：→ mary1017:我有用running buffer洗過 06/18 00:06