作者mary1017 (阿精)
看板Biotech
标题[求救] 配13公分大片胶的注胶问题
时间Sat Jun 15 00:56:09 2013
各位好:
因为整个系上只有我一个人做二维电泳
目前遇到一些问题,因此上来这里请求帮助了!
请不吝指教 非常感谢^^
目前遇到的最大问题是 跑完第一维的13公分IEF後
要配大片的SDS-PAGE作第二维电泳
我使用的配方是 30%ACRYLAMINE 18.75ML
1.5M TRIS 9.375ML
DD WATER 9.375 ML
1% APS 375uL
TEMED 18.75%
就是含有15%的ACRYLAMINE的胶
配完後有充分的震荡均匀
再拿塑胶吸管去注胶 两片玻璃片也先用95%酒精擦拭过了...
两侧的SPACER是比较厚的那种..
当我注完胶之後 马上用异丙醇压胶等待下胶凝固
问题就是:
胶的最上层的两侧角角应该要是直角形的!!
但我的胶凝固後 两边的角角都是往下凹的 呈圆弧状@@
配了好几次都会变成圆弧的角
这样我放吸了MARKER的滤纸片都会往旁边倒.歪歪的
跑出来的MARKER超级扭曲 好丑!
请问有甚麽技巧可以让胶注的好? 可以有直角...
若是我减少APS的量 让他凝固速度变慢,这样可以改善吗?
或是我压胶的速度放慢呢?
谢谢耐心看完文章^^
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 61.227.242.49
1F：→ blence:这组成，你的gel配方跟一般的PAGE本来就不一样吗？APS好低 06/15 01:35
2F：→ roy047:两边往下凹表示底下会漏... 06/15 09:25
※ 编辑: mary1017 来自: 140.116.162.76 (06/15 19:08)
3F：→ vandia:充分震荡均匀 <== 这样不会有小气泡嘛? 06/15 21:14
4F：→ mary1017:上层会有泡泡 我都先从下层开始吸 最後配完会剩一些 06/15 21:35
5F：→ mary1017:但是我没有漏胶的状况... 06/15 21:36
6F：→ mary1017:之前配小片7公分的胶 漏胶时也是一起往下降的说 @@ 06/15 21:36
7F：推 kakaman:2D大片胶气泡问题只要摇一摇敲一敲,气泡就浮上来了 06/16 11:53
8F：→ kakaman:会不会是你上方的spacer跟玻璃的密合有差 06/16 11:55
9F：→ mary1017:两侧的夹?子 (可以转紧的那种) 和玻璃片,spacer同样长度 06/16 16:10
10F：→ mary1017:不过我把异丙醇掉到,换成running buffer时 会看到胶的上 06/16 16:10
11F：→ mary1017:层和玻璃片之间有气泡出现 06/16 16:11
12F：→ mary1017:然後就会看到某边的角陷下去变成圆弧形的了 @@ 06/16 16:12
13F：→ mary1017:还是改成从中间处加异丙醇呢? 之前都是由一侧spacer紧贴 06/16 16:13
14F：→ mary1017:的加异丙醇压胶,然後那侧就会凹陷.... 06/16 16:13
15F：→ Invec:所有溶液有恢复到室温再开始配吗 06/16 18:08
16F：推 martyrtitan:震荡完要先抽气，再加入APS和TEMED 06/16 21:37
17F：推 kakaman:我回想起以前作2D的惨痛日子了... 06/17 00:03
18F：→ kakaman:你跑一维是用strip吗? 06/17 00:04
19F：→ kakaman:的确我以前在作很靠近边边,胶也会有点圆弧 06/17 00:06
20F：→ kakaman:但是我记得strip比胶还短的多 06/17 00:06
21F：→ kakaman:你可以先放水在放strip接着吸乾水,放maker 06/17 00:09
22F：→ kakaman:最後在倒agarose把他封起来 06/17 00:10
23F：→ kakaman:其实maker稍丑无所谓,重要的是你最後的蛋白点 06/17 00:11
24F：→ kakaman:所以你稍微调整一下maker,strip在胶上的位置,应该改善 06/17 00:13
25F：→ kakaman:我之前作Maker都摆得很正没东倒西歪过 06/17 00:14
回KAKAMAN:我是用13公分的strip跑第一维..但strip两端塑胶片剪掉後放到SDS PAGE上
的时後就只剩一点点的位子可以放滤纸了 @@
我是先把异丙醇倒掉..换成RUNNGING BUFFER 加到满~接下来把STRIP放下去,
等它沉下去之後,再用针头把BUFFER尽量吸乾
最後放滤纸
※ 编辑: mary1017 来自: 140.116.162.76 (06/17 18:07)
这次我有把配胶的溶液都放到常温之下
并且改成从中间的部分去LOADING异丙醇... 胶凝固後,没有之前出现的圆弧形角角了!
希望下次还可以作成功!
很谢谢大家的帮忙 ^^ 十分感谢!
※ 编辑: mary1017 来自: 140.116.162.76 (06/17 18:11)
※ 编辑: mary1017 来自: 140.116.162.76 (06/17 18:13)
26F：→ vandia:异丙醇倒掉有没有先用二次水冲过啊? 06/17 22:10
27F：→ mary1017:我有用running buffer洗过 06/18 00:06