作者TW185930 (吱吱)
看板Biotech
標題[求救] Western的 band看起來非常怪
時間Thu Jun 13 16:52:55 2013
我是做p67 phox的膜蛋白
之前實驗室沒有做過這個蛋白
(抗體 是用santa cruz 的 sc15342 這支)
用pierce的kit抽膜蛋白
用10% 的 sds page去跑
blocking 用5% 脫脂牛奶 (室溫搖一個小時)
抗體的稀釋是用 3% bsa以1:1000稀釋 (4度C overnight)
wash 是用 TBST洗
二抗是1:10000稀釋 (用5%脫脂牛奶稀釋)
使用uvp 照膠
我的問題band 都連在一起而且還糊糊的(如圖
http://i.imgur.com/fZeKPzm.png)
可是我的actin 就沒有這樣耶 (他們在同一片膠上)
actin 的band很正常
請問一下為什麼會這樣?? 有什麼解決的方法嗎??謝謝
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當他們關掉MegaUpload的時候， 我保持沉默；我還有FileSonic。
當他們關掉FileSonic的時候， 我保持沉默；我還有FileServe。
當他們關掉FileServe的時候， 我保持沉默；我還有MediaFire。
當他們關掉MediaFire的時候， 我保持沉默；我還有BT。
當他們關掉BT伺服器的時候， 我已一無所有了。
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.104.161
1F：推 puec2:有 actin的圖嗎 06/13 18:10
補ACTIN的圖
http://imgur.com/GsH6Do3 感謝你
※ 編輯: TW185930 來自: 140.120.104.161 (06/13 19:33)
2F：推 mingchao:lysis buffer 確認一下 以前配錯buffer 有跑出這樣來過 06/13 21:48
3F：→ mingchao:分子量較大的就像你這樣 ACTIN都很正常~ 06/13 21:49
4F：→ blence:我猜不會是buffer,因為marker也是,而且這個p67跟actin的MW 06/13 21:57
5F：→ blence:連差1倍都不到,很難說分子量影響 06/13 21:58
6F：→ blence:我想猜把BSA換成milk就好 06/13 22:06
7F：推 martyrtitan:........其實我直接猜是因為SC的抗體XDDDD 06/13 23:53
8F：→ martyrtitan:另外..膜蛋白用Actin做internal? 06/13 23:54
9F：推 puec2:應該是GEL裁太小塊 transfer的時候店場不均勻所造成 06/14 11:52
10F：→ puec2:你可以試試看不要裁直接transfer 06/14 11:52
感謝mingchao blence martyrtitan puec2
好! 我試試看!
※ 編輯: TW185930 來自: 140.120.104.161 (06/14 13:30)
※ 編輯: TW185930 來自: 140.120.104.161 (06/14 13:38)
11F：推 kakaman:膜蛋白應該要用membrane上的一些pump作control吧 06/16 11:59
12F：→ kakaman:另外膜蛋白你用什麼方式煮? 06/16 12:01
13F：→ kakaman:之前我在作600KDa的膜蛋白時,有位老師跟我說膜蛋白 06/16 12:02
14F：→ kakaman:加sample buffer用37度西煮半小時 06/16 12:04
15F：推 martyrtitan:membrane protein很容易聚集 要小心 06/16 21:35
16F：推 keeny:你是抽哪種膜蛋白? 如果是plasma membrane不該跑的出actin! 06/17 12:54
17F：→ keeny:如果是organelle membrane (ER or Golgi)那就OK. 06/17 12:56
18F：→ keeny:假設你的一抗品質沒問題,我建議用RIPA製備protein lysates 06/17 12:58
19F：→ keeny:之後再用sonicater確定充分的lyze membrane protein. 06/17 12:59
20F：→ keeny:transfer應該問題不大 不然actin 不會如此漂亮 06/17 13:00
21F：推 keeny:不過你的kit如果只能isolate membrane protein 的話 06/17 13:03
22F：→ keeny:即使你收的是ER或Golgi你還是不能用actin.有可能是個不好kit 06/17 13:04
23F：→ keeny:有一大堆cytosolic protein contamination. 06/17 13:05
我是抽NADPH氧化酶(細胞膜上的蛋白)， 我老師堅持說要 以actin當作control ......
※ 編輯: TW185930 來自: 140.120.104.161 (06/17 14:53)
24F：推 greendeer:還是你要上超高速去做fractination? 06/26 20:57