作者TW185930 (吱吱)
看板Biotech
标题[求救] Western的 band看起来非常怪
时间Thu Jun 13 16:52:55 2013
我是做p67 phox的膜蛋白
之前实验室没有做过这个蛋白
(抗体 是用santa cruz 的 sc15342 这支)
用pierce的kit抽膜蛋白
用10% 的 sds page去跑
blocking 用5% 脱脂牛奶 (室温摇一个小时)
抗体的稀释是用 3% bsa以1:1000稀释 (4度C overnight)
wash 是用 TBST洗
二抗是1:10000稀释 (用5%脱脂牛奶稀释)
使用uvp 照胶
我的问题band 都连在一起而且还糊糊的(如图
http://i.imgur.com/fZeKPzm.png)
可是我的actin 就没有这样耶 (他们在同一片胶上)
actin 的band很正常
请问一下为什麽会这样?? 有什麽解决的方法吗??谢谢
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当他们关掉MegaUpload的时候， 我保持沉默；我还有FileSonic。
当他们关掉FileSonic的时候， 我保持沉默；我还有FileServe。
当他们关掉FileServe的时候， 我保持沉默；我还有MediaFire。
当他们关掉MediaFire的时候， 我保持沉默；我还有BT。
当他们关掉BT伺服器的时候， 我已一无所有了。
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.104.161
1F：推 puec2:有 actin的图吗 06/13 18:10
补ACTIN的图
http://imgur.com/GsH6Do3 感谢你
※ 编辑: TW185930 来自: 140.120.104.161 (06/13 19:33)
2F：推 mingchao:lysis buffer 确认一下 以前配错buffer 有跑出这样来过 06/13 21:48
3F：→ mingchao:分子量较大的就像你这样 ACTIN都很正常~ 06/13 21:49
4F：→ blence:我猜不会是buffer,因为marker也是,而且这个p67跟actin的MW 06/13 21:57
5F：→ blence:连差1倍都不到,很难说分子量影响 06/13 21:58
6F：→ blence:我想猜把BSA换成milk就好 06/13 22:06
7F：推 martyrtitan:........其实我直接猜是因为SC的抗体XDDDD 06/13 23:53
8F：→ martyrtitan:另外..膜蛋白用Actin做internal? 06/13 23:54
9F：推 puec2:应该是GEL裁太小块 transfer的时候店场不均匀所造成 06/14 11:52
10F：→ puec2:你可以试试看不要裁直接transfer 06/14 11:52
感谢mingchao blence martyrtitan puec2
好! 我试试看!
※ 编辑: TW185930 来自: 140.120.104.161 (06/14 13:30)
※ 编辑: TW185930 来自: 140.120.104.161 (06/14 13:38)
11F：推 kakaman:膜蛋白应该要用membrane上的一些pump作control吧 06/16 11:59
12F：→ kakaman:另外膜蛋白你用什麽方式煮? 06/16 12:01
13F：→ kakaman:之前我在作600KDa的膜蛋白时,有位老师跟我说膜蛋白 06/16 12:02
14F：→ kakaman:加sample buffer用37度西煮半小时 06/16 12:04
15F：推 martyrtitan:membrane protein很容易聚集 要小心 06/16 21:35
16F：推 keeny:你是抽哪种膜蛋白? 如果是plasma membrane不该跑的出actin! 06/17 12:54
17F：→ keeny:如果是organelle membrane (ER or Golgi)那就OK. 06/17 12:56
18F：→ keeny:假设你的一抗品质没问题,我建议用RIPA制备protein lysates 06/17 12:58
19F：→ keeny:之後再用sonicater确定充分的lyze membrane protein. 06/17 12:59
20F：→ keeny:transfer应该问题不大 不然actin 不会如此漂亮 06/17 13:00
21F：推 keeny:不过你的kit如果只能isolate membrane protein 的话 06/17 13:03
22F：→ keeny:即使你收的是ER或Golgi你还是不能用actin.有可能是个不好kit 06/17 13:04
23F：→ keeny:有一大堆cytosolic protein contamination. 06/17 13:05
我是抽NADPH氧化酶(细胞膜上的蛋白)， 我老师坚持说要 以actin当作control ......
※ 编辑: TW185930 来自: 140.120.104.161 (06/17 14:53)
24F：推 greendeer:还是你要上超高速去做fractination? 06/26 20:57