作者cdkcyclin (ilovesuju)
看板Biotech
標題[求救] IP總是出現non-specific band
時間Fri Jun 7 23:31:37 2013
各位板友好，
我的實驗是想透過IP研究蛋白質A和N在腦瘤細胞中是否有直接的interaction。
我將V5-A和Flag-N的plasmid，同時transfect到細胞中，之後就可以利用V5或是Flag抗體
來pull down (control組用mIgG)。跑完WB之後，用V5與Flag抗體來偵測所抓下來的蛋白
質。
可是我現在遇到一個問題了。在我的IgG組，總是會偵測到一個non-specific band， 而
且這個band的位置，正好與Flag-N的大小幾乎一樣(大約110kD)。
為什麼我會知道那是non-specific band，而不是Flag-N。因為我之前做了一個簡單的測
試，我只transfect V5-A (沒有Flag-N)，然後用IgG與V5抗體去pull down。之後我將跑
完的膠，還是用Flag抗體來hybridize，結果在同樣的位置也出現這條band。
我附上我做的測試實驗，這樣子應該會更清楚。
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=hahaha93&b=1&f=1050765560&p=0
希望如果有對IP很有經驗的版友們，可以給我一些建議，
或是有人願意跟我討論實驗就太好了，多謝大家了。
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 141.50.39.150
1F：推 leoblack:不能換別種species的Ab再做一次IP嘛?! 06/07 23:51
2F：→ blence:我會想把WB的Flag換一下,因為看起來不是IP的問題 06/08 00:01
3F：推 joseph103331:這是二抗的問題 會認到IP用的抗體 06/08 23:54
4F：→ joseph103331:理想上IP的抗體用的物種跟WB用的不一樣最乾淨 06/08 23:55
5F：→ joseph103331:換tag一樣要避開物種 不然有極大可能會有一樣的問題 06/08 23:59
6F：→ blence:如果是二抗問題,mouse二抗並沒有認到mFlag喔,除非曝光不夠 06/09 02:10
7F：→ blence:我說的換Flag當然是換別物種或換支Ab clone,而非換其他tag 06/09 02:17
8F：→ cdkcyclin:謝謝各位,所以我如果用別物種的anti-flag Ab for WB 06/09 04:12
9F：→ cdkcyclin:應該可以避免二抗結合到IP用的抗體上囉 06/09 04:15
10F：→ cdkcyclin:blence大說的也很有道理，但在我別次的IP實驗中， 06/09 04:19
11F：→ cdkcyclin:當我用Flag Ab IP時,比較沒有這個問題,但IgG組一直都有 06/09 04:21
12F：→ cdkcyclin:non-specific band的產生 06/09 04:22
13F：推 joseph103331:不同支抗體可能會有不一樣的band出來 很難講呢 06/09 17:51
14F：→ joseph103331:換WB的抗體問題應該可以解決 06/09 17:52