作者cdkcyclin (ilovesuju)
看板Biotech
标题[求救] IP总是出现non-specific band
时间Fri Jun 7 23:31:37 2013
各位板友好，
我的实验是想透过IP研究蛋白质A和N在脑瘤细胞中是否有直接的interaction。
我将V5-A和Flag-N的plasmid，同时transfect到细胞中，之後就可以利用V5或是Flag抗体
来pull down (control组用mIgG)。跑完WB之後，用V5与Flag抗体来侦测所抓下来的蛋白
质。
可是我现在遇到一个问题了。在我的IgG组，总是会侦测到一个non-specific band， 而
且这个band的位置，正好与Flag-N的大小几乎一样(大约110kD)。
为什麽我会知道那是non-specific band，而不是Flag-N。因为我之前做了一个简单的测
试，我只transfect V5-A (没有Flag-N)，然後用IgG与V5抗体去pull down。之後我将跑
完的胶，还是用Flag抗体来hybridize，结果在同样的位置也出现这条band。
我附上我做的测试实验，这样子应该会更清楚。
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=hahaha93&b=1&f=1050765560&p=0
希望如果有对IP很有经验的版友们，可以给我一些建议，
或是有人愿意跟我讨论实验就太好了，多谢大家了。
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 141.50.39.150
1F：推 leoblack:不能换别种species的Ab再做一次IP嘛?! 06/07 23:51
2F：→ blence:我会想把WB的Flag换一下,因为看起来不是IP的问题 06/08 00:01
3F：推 joseph103331:这是二抗的问题 会认到IP用的抗体 06/08 23:54
4F：→ joseph103331:理想上IP的抗体用的物种跟WB用的不一样最乾净 06/08 23:55
5F：→ joseph103331:换tag一样要避开物种 不然有极大可能会有一样的问题 06/08 23:59
6F：→ blence:如果是二抗问题,mouse二抗并没有认到mFlag喔,除非曝光不够 06/09 02:10
7F：→ blence:我说的换Flag当然是换别物种或换支Ab clone,而非换其他tag 06/09 02:17
8F：→ cdkcyclin:谢谢各位,所以我如果用别物种的anti-flag Ab for WB 06/09 04:12
9F：→ cdkcyclin:应该可以避免二抗结合到IP用的抗体上罗 06/09 04:15
10F：→ cdkcyclin:blence大说的也很有道理，但在我别次的IP实验中， 06/09 04:19
11F：→ cdkcyclin:当我用Flag Ab IP时,比较没有这个问题,但IgG组一直都有 06/09 04:21
12F：→ cdkcyclin:non-specific band的产生 06/09 04:22
13F：推 joseph103331:不同支抗体可能会有不一样的band出来 很难讲呢 06/09 17:51
14F：→ joseph103331:换WB的抗体问题应该可以解决 06/09 17:52