板上各位先進好 本人最近在做免疫沉澱(IP)，目的是想看細胞內某蛋白ubiquitination的情形， 但本人是免疫沉澱新手，有許多細節還不太清楚，目前操作步驟如下述， 希望板上先進可以幫忙看看有沒有須改進的地方，最後面還有一些雞毛蒜皮的問題， 也希望能為小弟一併解答..... (小弟表達能力不太好，若看不太懂請見諒...) -------------------------------------------------------------------------------------------- Cell Lysate Preparation RIPA (for cell lysis) 150 mM NaCl 50 mM Tris-Cl (pH 7.4) 1 mM EDTA 1.0% Nonidet P-40 (NP-40) 0.1% SDS 0.5% Sodium deoxycholate 使用前加Protease Inhibitor 1. 以冰PBS wash dish 2次，傾斜plate將殘餘PBS移除乾淨， 每10cm dish加 100 uL cold RIPA，冰上刮下到離心管， 冰上靜置30分鐘，每5分鐘強力vortex 10秒。 2. 12,000 rpm離心15分鐘，4度C。 3. 取上清到新離心管置於冰上，測蛋白濃度，當日接著做IP。 Immunoprecipitation 1. 磁珠去除保存液，以 PBS+0.1% Tween 20 (後稱PBST) 洗2次， 然後加入PBST待用(體積同取出磁珠液時的體積)。 2. 取 100-200 ug Lysate (體積 100 uL以內)，以RIPA補到 100 uL。 3. 加入 50 uL 磁珠，再補 100 uL PBST，至此IP反應總體積 250 uL。 4. 加入 1 ug Capture Ab，以parafilm封口，4度C下翻轉反應overnight。 5. 去除上清留下磁珠，以PBST wash 3次。 Elution 磁珠加入 40 uL 1X Loading Buffer，95度C下震盪10分鐘後， 插冰上稍微冷卻後，立即將液體移到新管(約剩 30 uL 多一點點)。 Western Blot 每個sample load 30 uL (因為此部分比較沒有疑慮，所以就不多加敘述了) -------------------------------------------------------------------------------------------- 另外，還有下面的問題想請教各位： 1. 如果要排除protein-protein interaction，以RIPA收下lysate後， 是否需要先95度C煮過再做IP? 目前做的是都沒先煮過，RIPA看資料說是強力的lysis Buffer， 內含的ionic detergent已可破壞protein-protein interaction， 但是學長說要煮才對，不知道是不是我認知錯誤? 可是也有人說不用煮。 雖然先煮過理論上是可以保證非共價的interaction會被破壞， 但又怕太激烈ubiquitin的共價鍵會斷 (理論上是不會斷啦...實際上就不知道了)。 2. 若lysate有點黏稠(DNA釋出?)，是否可用sonication將其震過? sonication會不會讓ubiquitin鍊斷裂? (共價的DNA分子都可以斷的話...) 3. 我查網路上的資料，RIPA的環境下應該可直接進行Ab和target protein的binding， 但還是怕裡面的SDS太強，所以用PBST稀釋了，不知道這樣可不可以? 如果可以，能再用更多的PBST把RIPA稀釋嗎? 還是需要改用其他buffer? 4. Pre-clear是否為IP必要步驟? Pre-clear可再加IgG isotype去除樣本跟IgG的非特異性結合嗎? 5. IP後的wash該如何操作較適當? IP完之後的wash是否可以小力vortex懸浮磁珠， 還是說只需用wash buffer將磁珠沖過就好? 6. IP之後的wash是否可減少到2次? 因為我要看的是target protein上面ubiquitination的程度， 以前的朋友說看ubiquitination的話不能洗太多次。 7. Elution時是否需震盪? 我最後要從磁珠上elute蛋白時會用 1,000 rpm 震盪讓磁珠在加熱時懸浮， 想說讓elution比較完全，還是說根本完全沒必要震盪? 8. 跑膠Loading Sample時可否將磁珠一起load進去? 因為Elution後，雖然利用強力磁鐵分離磁珠， 但是還會有大概 5 uL 的Sample會殘留在磁珠團中， 不知道可不可以將磁珠一起load進去，減少Sample損失? 9. 用light chain-specific secondary antibody (monoclonal) 去認polyclonal rabbit primary antibody是否不需考慮認的light chain 是lambda還是kappa型的? --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 111.243.95.55 先感謝兩位板大指導...Protocol那邊我會再去問的 用MG132替代NEM加到lysate裡可以嗎? 剛好有現成的 磁座小弟是有用...只是磁珠被吸附後還是會沾黏部分液體，加上煮的時候會蒸發， 所以常常加40uL煮，最後只能回收30uL左右， 還是說根本不需顧慮損失多少體積，load膠時體積一樣就好? 另回W大，是要看total的。 ※ 編輯: cc1129 來自: 111.243.95.55 (06/09 23:50)