板上各位先进好 本人最近在做免疫沉淀(IP)，目的是想看细胞内某蛋白ubiquitination的情形， 但本人是免疫沉淀新手，有许多细节还不太清楚，目前操作步骤如下述， 希望板上先进可以帮忙看看有没有须改进的地方，最後面还有一些鸡毛蒜皮的问题， 也希望能为小弟一并解答..... (小弟表达能力不太好，若看不太懂请见谅...) -------------------------------------------------------------------------------------------- Cell Lysate Preparation RIPA (for cell lysis) 150 mM NaCl 50 mM Tris-Cl (pH 7.4) 1 mM EDTA 1.0% Nonidet P-40 (NP-40) 0.1% SDS 0.5% Sodium deoxycholate 使用前加Protease Inhibitor 1. 以冰PBS wash dish 2次，倾斜plate将残余PBS移除乾净， 每10cm dish加 100 uL cold RIPA，冰上刮下到离心管， 冰上静置30分钟，每5分钟强力vortex 10秒。 2. 12,000 rpm离心15分钟，4度C。 3. 取上清到新离心管置於冰上，测蛋白浓度，当日接着做IP。 Immunoprecipitation 1. 磁珠去除保存液，以 PBS+0.1% Tween 20 (後称PBST) 洗2次， 然後加入PBST待用(体积同取出磁珠液时的体积)。 2. 取 100-200 ug Lysate (体积 100 uL以内)，以RIPA补到 100 uL。 3. 加入 50 uL 磁珠，再补 100 uL PBST，至此IP反应总体积 250 uL。 4. 加入 1 ug Capture Ab，以parafilm封口，4度C下翻转反应overnight。 5. 去除上清留下磁珠，以PBST wash 3次。 Elution 磁珠加入 40 uL 1X Loading Buffer，95度C下震荡10分钟後， 插冰上稍微冷却後，立即将液体移到新管(约剩 30 uL 多一点点)。 Western Blot 每个sample load 30 uL (因为此部分比较没有疑虑，所以就不多加叙述了) -------------------------------------------------------------------------------------------- 另外，还有下面的问题想请教各位： 1. 如果要排除protein-protein interaction，以RIPA收下lysate後， 是否需要先95度C煮过再做IP? 目前做的是都没先煮过，RIPA看资料说是强力的lysis Buffer， 内含的ionic detergent已可破坏protein-protein interaction， 但是学长说要煮才对，不知道是不是我认知错误? 可是也有人说不用煮。 虽然先煮过理论上是可以保证非共价的interaction会被破坏， 但又怕太激烈ubiquitin的共价键会断 (理论上是不会断啦...实际上就不知道了)。 2. 若lysate有点黏稠(DNA释出?)，是否可用sonication将其震过? sonication会不会让ubiquitin链断裂? (共价的DNA分子都可以断的话...) 3. 我查网路上的资料，RIPA的环境下应该可直接进行Ab和target protein的binding， 但还是怕里面的SDS太强，所以用PBST稀释了，不知道这样可不可以? 如果可以，能再用更多的PBST把RIPA稀释吗? 还是需要改用其他buffer? 4. Pre-clear是否为IP必要步骤? Pre-clear可再加IgG isotype去除样本跟IgG的非特异性结合吗? 5. IP後的wash该如何操作较适当? IP完之後的wash是否可以小力vortex悬浮磁珠， 还是说只需用wash buffer将磁珠冲过就好? 6. IP之後的wash是否可减少到2次? 因为我要看的是target protein上面ubiquitination的程度， 以前的朋友说看ubiquitination的话不能洗太多次。 7. Elution时是否需震荡? 我最後要从磁珠上elute蛋白时会用 1,000 rpm 震荡让磁珠在加热时悬浮， 想说让elution比较完全，还是说根本完全没必要震荡? 8. 跑胶Loading Sample时可否将磁珠一起load进去? 因为Elution後，虽然利用强力磁铁分离磁珠， 但是还会有大概 5 uL 的Sample会残留在磁珠团中， 不知道可不可以将磁珠一起load进去，减少Sample损失? 9. 用light chain-specific secondary antibody (monoclonal) 去认polyclonal rabbit primary antibody是否不需考虑认的light chain 是lambda还是kappa型的? --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 111.243.95.55 先感谢两位板大指导...Protocol那边我会再去问的 用MG132替代NEM加到lysate里可以吗? 刚好有现成的 磁座小弟是有用...只是磁珠被吸附後还是会沾黏部分液体，加上煮的时候会蒸发， 所以常常加40uL煮，最後只能回收30uL左右， 还是说根本不需顾虑损失多少体积，load胶时体积一样就好? 另回W大，是要看total的。 ※ 编辑: cc1129 来自: 111.243.95.55 (06/09 23:50)