作者kelly2013 (kelly2013)
看板Biotech
標題[求救] RT-PCR
時間Mon May 13 13:20:31 2013
拜託大家幫幫我,這關係到我能否順利畢業,這裡先跟大家說一聲謝謝
我的細胞株使用神經膠質母細胞瘤,用不同濃度的藥處理後,
再用Trizol去純化RNA,然後測O.D.260/280,
每一個sample RNA conc固定為1,
接著再把RNA轉成cDNA做RT-PCR
因為我臨時出了一些狀況,所以mRNA純化成cDNA後就一直冰在4度c冰箱
我想說已經轉成cDNA,應該會很stable....所以它就躺在4度C冰箱整整一個月
昨天我把它拿出來做PCR時,internal control(我是使用GAPDH當internal control)
完全沒有equal,每個sample bend的粗細相異很大,還呈現不規則....
想拜託大家幫幫我,現在有沒有甚麼辦法可以挽救?
因為internal control差異那麼大,
根本無法說服別人相信我的數據
在此先謝謝大家
※ 編輯: kelly2013 來自: 192.192.90.30 (05/13 13:26)
1F：推 mesenchymal:改用Q-PCR, 或換control (如果你的藥會影響的話) 05/13 13:46
2F：推 ljii:同樓上,先確定你的藥會不會誘發GAPDH. 再來是放4度的問題, 05/13 14:52
3F：→ ljii:你的CDNA是用H2O elute嗎? 那在4度C放這麼久有可能會acid 05/13 14:53
4F：→ ljii:hydrolysis. 如果這樣的話你的cDNA量就不準了 05/13 14:53
我是用水溶的
5F：→ ljii:如果cDNA是在TE裡面會比較stable,但放那麼久也難說,尤其你要 05/13 14:54
6F：→ ljii:定量. 想必mRNA應該是安全的冰在-20或-80吧,何不重新作cDNA? 05/13 14:55
這一批sample轉cDNA 後的mRNA是冰在-80冰箱
可是mRNA更不穩定,至少已經放在冰箱兩個月了,
萬一之前轉cDNA過程中有甚麼閃失...
放那麼久的mRNA我真的不太敢再使用(因為我的sample加起來有將近六十管)
花時間事小,萬一轉失敗,一定會被罵浪費材料
可是重收細胞還要花很多時間
時間根本來不及...
※ 編輯: kelly2013 來自: 192.192.90.30 (05/13 17:59)
7F：推 ithinksoiam:RNA放在-80兩個月還ok吧 05/13 19:04
8F：→ ithinksoiam:可以先轉個一兩管試試看阿 05/13 19:04
9F：推 aceliang:有時間擔心轉失敗卻沒時間重收細胞，現在擺明東西不能用 05/13 20:53
10F：→ aceliang:你也只剩下重轉的選項而已了不瞞您說。 05/13 20:54
不是我不重收細胞,細胞不是我管控,不是說要就會有
而且因為一次要處理那麼多盤,
下禮拜就要口試再怎麼熬夜都來不及
所以才會想上來求救有沒有人有類似的經驗救成功的例子
11F：推 qiet:2個月OK拉~~~快快重轉吧 05/13 23:15
甚麼兩個月?
※ 編輯: kelly2013 來自: 192.192.90.30 (05/13 23:16)
12F：→ qiet:大不了先轉個幾管測試一下, 確認OK後再轉完剩下的 05/13 23:16
13F：→ rebirth:RNA放在-80兩個月比cDNA放4度一個月好多了 重轉就對了 05/13 23:29
14F：推 qiet:RNA -80兩個月, 05/13 23:33
15F：→ a90648:兩個月還好啦!!之前老師要補舊東西半年多前的RNA也沒問題 05/14 00:21
那O.D.260/280需要重測嗎?
我想先跟大家確認一下,
如果這個細胞加藥後確定GAPDH表現量是equal
但PCR結果卻是不equal...
這主要是因為我把cDNA放在四度C冰箱太久的緣故嗎?
有沒有可能是別的原因?
我本來想說是我手殘,所以又重新p一次GAPDH
但我發現第二次的結果跟第一次結果其實差異不大...
另外我想問一下,如果跑純化RNA後跑RNA電泳去看RNA的quality
如果18S跟28S位置的bend沒有很漂亮的話
是否代表這樣轉cDNA的quality也不會很好?
在這裡先感謝大家的幫忙
※ 編輯: kelly2013 來自: 192.192.90.30 (05/14 01:03)
16F：推 HEK293:我不太清楚你為什麼這麼堅持地想要在cDNA品質上做文章 05/14 08:39
因為我認為如果cDNA品質不好,可能會影響PCR的結果
17F：→ HEK293:但是現在很明顯你對你的材料並不很有信心，保存上也有瑕疵 05/14 08:39
18F：→ HEK293:重複兩次PCR結果相同，程度上代表你實驗操作問題不大 05/14 08:40
19F：→ HEK293:我想cDNA品質不佳的問題越來越明顯了，不是嘛？ 05/14 08:40
20F：→ HEK293:另RNA電泳18S/28S band不漂亮，確實轉cDNA效果會較差。 05/14 08:41
21F：→ HEK293:但如果細胞取得不易，那你的選擇也不很多，先轉就是了。 05/14 08:41
※ 編輯: kelly2013 來自: 192.192.90.30 (05/14 10:49)
22F：→ a90648:沒得選擇就只能重轉啦!! RNA濃度要再測一次 05/14 12:03
23F：→ atntt:RNA放-80一年都沒問題 如果一開始SAMPLE就是OK的話 05/14 23:06