作者kelly2013 (kelly2013)
看板Biotech
标题[求救] RT-PCR
时间Mon May 13 13:20:31 2013
拜托大家帮帮我,这关系到我能否顺利毕业,这里先跟大家说一声谢谢
我的细胞株使用神经胶质母细胞瘤,用不同浓度的药处理後,
再用Trizol去纯化RNA,然後测O.D.260/280,
每一个sample RNA conc固定为1,
接着再把RNA转成cDNA做RT-PCR
因为我临时出了一些状况,所以mRNA纯化成cDNA後就一直冰在4度c冰箱
我想说已经转成cDNA,应该会很stable....所以它就躺在4度C冰箱整整一个月
昨天我把它拿出来做PCR时,internal control(我是使用GAPDH当internal control)
完全没有equal,每个sample bend的粗细相异很大,还呈现不规则....
想拜托大家帮帮我,现在有没有甚麽办法可以挽救?
因为internal control差异那麽大,
根本无法说服别人相信我的数据
在此先谢谢大家
※ 编辑: kelly2013 来自: 192.192.90.30 (05/13 13:26)
1F：推 mesenchymal:改用Q-PCR, 或换control (如果你的药会影响的话) 05/13 13:46
2F：推 ljii:同楼上,先确定你的药会不会诱发GAPDH. 再来是放4度的问题, 05/13 14:52
3F：→ ljii:你的CDNA是用H2O elute吗? 那在4度C放这麽久有可能会acid 05/13 14:53
4F：→ ljii:hydrolysis. 如果这样的话你的cDNA量就不准了 05/13 14:53
我是用水溶的
5F：→ ljii:如果cDNA是在TE里面会比较stable,但放那麽久也难说,尤其你要 05/13 14:54
6F：→ ljii:定量. 想必mRNA应该是安全的冰在-20或-80吧,何不重新作cDNA? 05/13 14:55
这一批sample转cDNA 後的mRNA是冰在-80冰箱
可是mRNA更不稳定,至少已经放在冰箱两个月了,
万一之前转cDNA过程中有甚麽闪失...
放那麽久的mRNA我真的不太敢再使用(因为我的sample加起来有将近六十管)
花时间事小,万一转失败,一定会被骂浪费材料
可是重收细胞还要花很多时间
时间根本来不及...
※ 编辑: kelly2013 来自: 192.192.90.30 (05/13 17:59)
7F：推 ithinksoiam:RNA放在-80两个月还ok吧 05/13 19:04
8F：→ ithinksoiam:可以先转个一两管试试看阿 05/13 19:04
9F：推 aceliang:有时间担心转失败却没时间重收细胞，现在摆明东西不能用 05/13 20:53
10F：→ aceliang:你也只剩下重转的选项而已了不瞒您说。 05/13 20:54
不是我不重收细胞,细胞不是我管控,不是说要就会有
而且因为一次要处理那麽多盘,
下礼拜就要口试再怎麽熬夜都来不及
所以才会想上来求救有没有人有类似的经验救成功的例子
11F：推 qiet:2个月OK拉~~~快快重转吧 05/13 23:15
甚麽两个月?
※ 编辑: kelly2013 来自: 192.192.90.30 (05/13 23:16)
12F：→ qiet:大不了先转个几管测试一下, 确认OK後再转完剩下的 05/13 23:16
13F：→ rebirth:RNA放在-80两个月比cDNA放4度一个月好多了 重转就对了 05/13 23:29
14F：推 qiet:RNA -80两个月, 05/13 23:33
15F：→ a90648:两个月还好啦!!之前老师要补旧东西半年多前的RNA也没问题 05/14 00:21
那O.D.260/280需要重测吗?
我想先跟大家确认一下,
如果这个细胞加药後确定GAPDH表现量是equal
但PCR结果却是不equal...
这主要是因为我把cDNA放在四度C冰箱太久的缘故吗?
有没有可能是别的原因?
我本来想说是我手残,所以又重新p一次GAPDH
但我发现第二次的结果跟第一次结果其实差异不大...
另外我想问一下,如果跑纯化RNA後跑RNA电泳去看RNA的quality
如果18S跟28S位置的bend没有很漂亮的话
是否代表这样转cDNA的quality也不会很好?
在这里先感谢大家的帮忙
※ 编辑: kelly2013 来自: 192.192.90.30 (05/14 01:03)
16F：推 HEK293:我不太清楚你为什麽这麽坚持地想要在cDNA品质上做文章 05/14 08:39
因为我认为如果cDNA品质不好,可能会影响PCR的结果
17F：→ HEK293:但是现在很明显你对你的材料并不很有信心，保存上也有瑕疵 05/14 08:39
18F：→ HEK293:重复两次PCR结果相同，程度上代表你实验操作问题不大 05/14 08:40
19F：→ HEK293:我想cDNA品质不佳的问题越来越明显了，不是嘛？ 05/14 08:40
20F：→ HEK293:另RNA电泳18S/28S band不漂亮，确实转cDNA效果会较差。 05/14 08:41
21F：→ HEK293:但如果细胞取得不易，那你的选择也不很多，先转就是了。 05/14 08:41
※ 编辑: kelly2013 来自: 192.192.90.30 (05/14 10:49)
22F：→ a90648:没得选择就只能重转啦!! RNA浓度要再测一次 05/14 12:03
23F：→ atntt:RNA放-80一年都没问题 如果一开始SAMPLE就是OK的话 05/14 23:06