作者stephilow (天災已難防，媒災更煩人)
看板Biotech
標題[求救] southern transfer問題
時間Mon May 6 18:46:52 2013
我最近在做southern，但一直都做不出來
感覺上是transfer出問題。
原本都是用衛生紙裡用毛細現象將DNA轉漬到膜上，
過程:
run gel---0.25N HCl 10'---denature 15'*2---nutrolization 15'*2---10 SSC buffer
放膠的方式 (從下而上): gel-膜-圖畫紙-衛生紙-搭一個鹽橋-500 g去壓隔夜
***此方法一切都很OK，至少都會有band***
後來想說太慢，實驗室買了一台抽氣transfer機器
品名: Biorad Model 785 Vacuum Blotter
其流程(標準)是: 0.25 N HCl 15'*1---水洗---0.5 N NaOH 30'*1---水洗---10 SSC
90' (5 inch Hg)
做完的結果，只有很淡的marker (我load 10 ul)
連control plasmid也沒有hy到。
1. 因為我的探針有問題嗎? (探針size跑完膠看起來是比control要大)
探針處理是100 C煮沸10分鐘，放入冰上5分鐘。
2. 這樣transfer的效果很好，都沒有殘留，但是DNA會不會被抽到透過膜而跑掉?
3. 我也測試過用原本denature/nutrolization的方式後再加上抽氣，結果一樣。
請問有人用過這樣的方式transfer嗎?
有甚麼辦法可以解決嗎?
謝謝
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◆ From: 210.69.175.253
1F：推 skybreeze:抽氣式的要注意有沒有縫隙 靠近膠台 可以聽到 05/06 20:34
2F：→ skybreeze:如果有縫隙 會有嘶嘶的聲音 這樣transfer效率會變差 05/06 20:34
3F：→ nike77114:我個人認為抽氣式沒有傳統好用XDDD 05/06 21:13
4F：推 milkpa:如果原來的方式很好就不要改條件 05/07 09:28
5F：→ puec2:您為什麼這麼著急呢？ 05/10 17:01