作者stephilow (天灾已难防，媒灾更烦人)
看板Biotech
标题[求救] southern transfer问题
时间Mon May 6 18:46:52 2013
我最近在做southern，但一直都做不出来
感觉上是transfer出问题。
原本都是用卫生纸里用毛细现象将DNA转渍到膜上，
过程:
run gel---0.25N HCl 10'---denature 15'*2---nutrolization 15'*2---10 SSC buffer
放胶的方式 (从下而上): gel-膜-图画纸-卫生纸-搭一个盐桥-500 g去压隔夜
***此方法一切都很OK，至少都会有band***
後来想说太慢，实验室买了一台抽气transfer机器
品名: Biorad Model 785 Vacuum Blotter
其流程(标准)是: 0.25 N HCl 15'*1---水洗---0.5 N NaOH 30'*1---水洗---10 SSC
90' (5 inch Hg)
做完的结果，只有很淡的marker (我load 10 ul)
连control plasmid也没有hy到。
1. 因为我的探针有问题吗? (探针size跑完胶看起来是比control要大)
探针处理是100 C煮沸10分钟，放入冰上5分钟。
2. 这样transfer的效果很好，都没有残留，但是DNA会不会被抽到透过膜而跑掉?
3. 我也测试过用原本denature/nutrolization的方式後再加上抽气，结果一样。
请问有人用过这样的方式transfer吗?
有甚麽办法可以解决吗?
谢谢
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◆ From: 210.69.175.253
1F：推 skybreeze:抽气式的要注意有没有缝隙 靠近胶台 可以听到 05/06 20:34
2F：→ skybreeze:如果有缝隙 会有嘶嘶的声音 这样transfer效率会变差 05/06 20:34
3F：→ nike77114:我个人认为抽气式没有传统好用XDDD 05/06 21:13
4F：推 milkpa:如果原来的方式很好就不要改条件 05/07 09:28
5F：→ puec2:您为什麽这麽着急呢？ 05/10 17:01