作者allthebest (allthebest)
看板Biotech
標題[求救] glycerol stock 若是被雜菌污染
時間Sat May 4 23:46:37 2013
事由:plasmid transfection細胞後一直污染
做法:stock 種midi 然後抽plasmid
plasmid+jetpei+transfers buffer 做transfection(24hr觀察就有長菌了)
已重抽兩遍....做transform都有污染...
已做的truble shooting:
1.2.3.buffer,plasmid,jetpei only
4.plasmid+buffer+jetpei
結果1，2，3乾淨4又長菌了(我要崩潰了)到底為什麼啦？(爆氣
尤其是我一次抽很多不同midi 只有這一隻plasmid怪怪的 總之我決定重新transform
不過先假設是我眼殘(沒在plasmid only看到有菌)真的是plasmid有污染好了 我很好奇如果在stock有雜菌在抽完plasmid後也會有菌菌污染嗎？(我很確定elution buffer是乾淨的)但就算stock有雜菌我最後不是也只會得到雜菌的plasmid嗎？？？
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◆ From: 101.9.217.244
1F：→ xxtomnyxx:你有試過把plasmid在hood中做酒精沉澱重新回溶嗎？ 05/05 01:04
2F：→ allthebest:沒有耶 不過我用的midi prep kit的wash buffer倒是有 05/05 01:50
3F：→ allthebest:所以x大的意思是 抽完並elute出來的plasmid要再做一次 05/05 01:52
4F：→ xxtomnyxx:如果你已經抽出plasmid，卻懷疑他可能有汙染，可以再做 05/05 13:26
5F：→ xxtomnyxx:一次酒精沉澱把汙染物去掉。 05/05 13:27
6F：→ xxtomnyxx:基本上凍菌就算有汙染，也只會讓你種LB時就長雜菌或發霉 05/05 13:28
7F：→ xxtomnyxx:，或是抽出莫名其妙的plasmid，不會把汙染物帶到elute中 05/05 13:29
8F：→ xxtomnyxx:，因為抽plasmid的buffer 2 基本上會殺光細菌黴菌。 05/05 13:29
9F：→ xxtomnyxx:你有試過排除其他可能汙染源嗎？例如把medium拿去incub- 05/05 13:30
10F：→ xxtomnyxx:ator 放個1、2天？ 05/05 13:30
11F：→ roy047:同意樓上~不然每次transfection都會有E.coli汙染(也是菌啊) 05/05 20:54
12F：→ roy047:測: plasmid only, jetPEI only, serum free medium only 05/05 20:56
13F：→ roy047:serum free medium是transfection時使用的那個 05/05 20:56
14F：→ roy047:orz 有點搞錯 jetPEI是用NaCl, 不是用medium 就測NaCl看看 05/05 21:00
15F：→ roy047:然後可以測久一點 有時因時間太短不明顯所以會誤判沒汙染 05/05 21:03
16F：推 kevin1983:buffer2含SDS不就破菌了嗎？stock有污染也不會到plasmid 05/05 22:22
17F：→ allthebest:我也知道問題有點蠢 因為發文後半段也有寫頂多只抽出 05/06 14:53
18F：→ allthebest:雜菌的plasmid 05/06 14:54
19F：→ allthebest:我也有空培 back only,plasmid only 05/06 14:55
20F：推 HEK293:雜菌的plasmid是三小？ 05/06 14:55
21F：→ allthebest:nacl only (打錯 05/06 14:55
22F：→ allthebest:請連著看 ="= 05/06 14:57
23F：推 silentence:怕抽到雜菌的拿去enzyme digestion跑膠看看阿 05/10 16:13