作者emilyliu (微笑下的真實)
看板Biotech
標題[求救] 請幫忙解決關於組織萃核蛋白問題
時間Fri May 3 15:32:45 2013
最近的實驗要萃動物組織(坐骨神經)的核蛋白跑EMSA，幾次萃下來分別拿收
得的cytosolic 和 nuclear protein先去跑western，但兩者不管是在b-tubulin
還是PCNA都有壓出的band且都很明顯，表示我萃核蛋白的方法可能有問題，
我不是用市面上kit去萃的，上網查過很多關於萃核蛋白的protocol和自己的
對照其實方法原理幾乎大同小異，也不確定相同的方法對於萃細胞核蛋白和
組織核蛋白理論上應該都是行得通的吧？可是就是無法萃得可以分的很清楚
的核蛋白和質蛋白。以下是我使用的protocol 想請有經驗的板友指點在哪
個步驟上可能有問題需要修改，一直萃不出核蛋白實驗無法繼續進行實在
很困擾阿QQ
1 組織是長度約1 cm 的大鼠坐骨神經，在PBS rinse 過一次後加入540ul
的cell lyisis buffer (10mM HEPES, 10mM KCl, 1.5mM MgCl2,5mM DTT,5mM
PMSF)用小剪將組織盡量剪碎至無顆粒，冰上反應30 min
2 加入5％的NP40(我是用cell lysis buffer dilute的)，和前一步驟加入
的cell lysis buffer 按照1:9的比例，故取50ul加入。強力震盪1分30秒
關於這裡我發現似乎大家使用的NP40濃度都不太相同，從0.5%~10%都有，
另也有使用Triton ，不曉得不同濃度比例對於萃取的效果是否有很大的
差別？
3 12000rpm 4度C 1min ，收上清液(cytosolic protein)後再加入
cell lysis buffer 600ul ,震盪後相同條件再離心一次。
4 加入100ul nuclear extration buffer(20mM HEPES, 0.2mM EDTA,
10% glycerol, 1.5mM Mgcl2, 420mM NaCl,1mM DTT, 0.5mM PMSF)，冰上反應
30 min 期間不時震盪
5 12000rpm 4度C 15 min ，收上清液(nuclear protein)
離心轉速條件我的protocol上不管在哪一個步驟都是12000rpm ，但我看其
他很多都至少使用10000g以上 離心時間也是有長有短，我試過20000g
10 min 但跑wetern 出來還是一樣的結果.
以上是我萃核蛋白的過程，希望有萃組織核蛋白經驗的板友可以指教 謝謝！
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◆ From: 59.126.60.2
1F：→ chaunen:buffer感覺很濃ㄟ? 應該是mM? tritonX-100應該會破核吧? 05/04 19:34
2F：→ blence:整篇濃度都很奇怪,你有reference嗎？ 05/05 01:02
3F：→ emilyliu:阿不好意思濃度好像有標錯＠＠，回實驗室check後會修改 05/05 16:08
不好意思之前都key成實驗室stock的濃度，萃時會稀釋成上述的濃度
※ 編輯: emilyliu 來自: 114.46.155.234 (05/07 19:46)
4F：→ Ianthegood:要不要換個control試試看 05/11 17:12
5F：→ Ianthegood:我收核大概都只用1000g耶 太快不知道會不會把核壓碎 05/11 17:13