作者emilyliu (微笑下的真实)
看板Biotech
标题[求救] 请帮忙解决关於组织萃核蛋白问题
时间Fri May 3 15:32:45 2013
最近的实验要萃动物组织(坐骨神经)的核蛋白跑EMSA，几次萃下来分别拿收
得的cytosolic 和 nuclear protein先去跑western，但两者不管是在b-tubulin
还是PCNA都有压出的band且都很明显，表示我萃核蛋白的方法可能有问题，
我不是用市面上kit去萃的，上网查过很多关於萃核蛋白的protocol和自己的
对照其实方法原理几乎大同小异，也不确定相同的方法对於萃细胞核蛋白和
组织核蛋白理论上应该都是行得通的吧？可是就是无法萃得可以分的很清楚
的核蛋白和质蛋白。以下是我使用的protocol 想请有经验的板友指点在哪
个步骤上可能有问题需要修改，一直萃不出核蛋白实验无法继续进行实在
很困扰阿QQ
1 组织是长度约1 cm 的大鼠坐骨神经，在PBS rinse 过一次後加入540ul
的cell lyisis buffer (10mM HEPES, 10mM KCl, 1.5mM MgCl2,5mM DTT,5mM
PMSF)用小剪将组织尽量剪碎至无颗粒，冰上反应30 min
2 加入5％的NP40(我是用cell lysis buffer dilute的)，和前一步骤加入
的cell lysis buffer 按照1:9的比例，故取50ul加入。强力震荡1分30秒
关於这里我发现似乎大家使用的NP40浓度都不太相同，从0.5%~10%都有，
另也有使用Triton ，不晓得不同浓度比例对於萃取的效果是否有很大的
差别？
3 12000rpm 4度C 1min ，收上清液(cytosolic protein)後再加入
cell lysis buffer 600ul ,震荡後相同条件再离心一次。
4 加入100ul nuclear extration buffer(20mM HEPES, 0.2mM EDTA,
10% glycerol, 1.5mM Mgcl2, 420mM NaCl,1mM DTT, 0.5mM PMSF)，冰上反应
30 min 期间不时震荡
5 12000rpm 4度C 15 min ，收上清液(nuclear protein)
离心转速条件我的protocol上不管在哪一个步骤都是12000rpm ，但我看其
他很多都至少使用10000g以上 离心时间也是有长有短，我试过20000g
10 min 但跑wetern 出来还是一样的结果.
以上是我萃核蛋白的过程，希望有萃组织核蛋白经验的板友可以指教 谢谢！
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◆ From: 59.126.60.2
1F：→ chaunen:buffer感觉很浓ㄟ? 应该是mM? tritonX-100应该会破核吧? 05/04 19:34
2F：→ blence:整篇浓度都很奇怪,你有reference吗？ 05/05 01:02
3F：→ emilyliu:阿不好意思浓度好像有标错＠＠，回实验室check後会修改 05/05 16:08
不好意思之前都key成实验室stock的浓度，萃时会稀释成上述的浓度
※ 编辑: emilyliu 来自: 114.46.155.234 (05/07 19:46)
4F：→ Ianthegood:要不要换个control试试看 05/11 17:12
5F：→ Ianthegood:我收核大概都只用1000g耶 太快不知道会不会把核压碎 05/11 17:13