作者jeffsu (歐巴馬)
看板Biotech
標題[求救] promoter cloning
時間Tue Apr 9 14:13:26 2013
這實驗目前已經卡了一陣子 希望版友能幫忙看看有甚麼問題
目前我的實驗是想看TIMP3 promoter 的轉錄活性
所以選定了一段-934~+278的位置 想接到pGL3-Basic vecter 上
利用軟體分析之後設計不含此序列切位的primer
5'端加上XhoI切位 primer 3'端加上HindIII切位
使用Pfx PCR 之後 跑膠確定為single band
接著取1ug的PCR產物 與1ug的vector 同時切XhoI及HindIII 後OVER NIGHT
隔天跑膠後將之切膠純化(也有使用直接純化的方法)
以vecter:insert 1:3 1:10等比例 ligation 16度 overnight後
隔天進行transformation，也順便塗一盤單純用BASIC的
結果只有BASIC有長，而切膠純化後的都沒有長
直接純化不切膠的有長很多，但PCR確認過都是空載體（可能酵素作用不完全BASIC長的）
不知道板上有沒有好心人能幫忙看看到底那邊出了問題
感激不盡！～～
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.128.138.38
1F：推 puec2:Primer末端的cutting site有沒有多留幾個mer? 04/09 14:40
2F：→ jeffsu:想問看看cutting site加幾個mer的意義是？? 04/09 17:20
3F：推 qiet:要多留一些mer讓酵素有地方可以站上去在specific site作用 04/09 17:24
4F：→ jeffsu:那加的mer有限定要ATGC哪種嗎 還是都可以 04/09 17:26
5F：推 milkpa:看酵素datasheet裡面都有寫，要留幾個以上跟偏好的基都有 04/09 17:32
6F：推 licat:看你的描述我可以想到好多可能的問題... 我覺得最快的方法是 04/09 21:57
7F：→ licat:找一個你附近作cloning很順的人 跟他一步步確認你的做法 04/09 21:58
8F：→ licat:最好是可以請他幫你做 全照他的方式來做 然後你在旁邊看跟學 04/09 21:58
9F：→ blence:PCR產物有1ug以上,好奇你如何定量的,如果真用這麼多還做不 04/10 00:21
10F：→ blence:出來,實在需要找個會做的人在旁指導了,不少描述都有問題 04/10 00:22
11F：推 joseph103331:甚麼是直接純化.... 04/10 02:46
12F：→ joseph103331:問一下 你選的位置應該沒有轉譯起始點吧? 04/10 02:47
14F：→ mesenchymal:好巧不巧 這兩個酵素沒多留幾個mer切再久效率都很差 04/10 07:18
15F：推 mesenchymal:看推文你似乎沒多放,所以先從這著手吧 04/10 07:21
16F：→ jeffsu:這部分我們實驗室也算剛入門能問的人不多 很感謝大家的回答 04/10 10:45
17F：→ jeffsu:我在研究看看 04/10 10:45
18F：→ jeffsu:回j大 這段序列沒包含到轉譯起始點 04/10 10:56
19F：→ jeffsu:不知道是不是需要包含到? 04/10 11:01
20F：推 HEK293:做TA也是可以。 04/10 11:56
21F：→ jeffsu:用pfx去PCR 好像不能用TA作的樣子 04/10 13:01
22F：推 HEK293:加個a而已........= =做個tailing 04/10 13:38
23F：→ jeffsu:瞭解了 感謝指導!! 04/10 16:23
24F：推 chaunen:我覺得問題應該就是mesenchymal大大說的..Y 04/12 01:18
25F：→ chaunen:所以inser其實沒有被切 也就接不上囉 04/12 01:19
26F：→ chaunen:ligation product可以拿去跑PCR先check 很快就知道結果了 04/12 01:20
27F：→ chaunen:cloning還是一步一步check比較能找出問題. 04/12 01:28