作者jeffsu (欧巴马)
看板Biotech
标题[求救] promoter cloning
时间Tue Apr 9 14:13:26 2013
这实验目前已经卡了一阵子 希望版友能帮忙看看有甚麽问题
目前我的实验是想看TIMP3 promoter 的转录活性
所以选定了一段-934~+278的位置 想接到pGL3-Basic vecter 上
利用软体分析之後设计不含此序列切位的primer
5'端加上XhoI切位 primer 3'端加上HindIII切位
使用Pfx PCR 之後 跑胶确定为single band
接着取1ug的PCR产物 与1ug的vector 同时切XhoI及HindIII 後OVER NIGHT
隔天跑胶後将之切胶纯化(也有使用直接纯化的方法)
以vecter:insert 1:3 1:10等比例 ligation 16度 overnight後
隔天进行transformation，也顺便涂一盘单纯用BASIC的
结果只有BASIC有长，而切胶纯化後的都没有长
直接纯化不切胶的有长很多，但PCR确认过都是空载体（可能酵素作用不完全BASIC长的）
不知道板上有没有好心人能帮忙看看到底那边出了问题
感激不尽！～～
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.128.138.38
1F：推 puec2:Primer末端的cutting site有没有多留几个mer? 04/09 14:40
2F：→ jeffsu:想问看看cutting site加几个mer的意义是？? 04/09 17:20
3F：推 qiet:要多留一些mer让酵素有地方可以站上去在specific site作用 04/09 17:24
4F：→ jeffsu:那加的mer有限定要ATGC哪种吗 还是都可以 04/09 17:26
5F：推 milkpa:看酵素datasheet里面都有写，要留几个以上跟偏好的基都有 04/09 17:32
6F：推 licat:看你的描述我可以想到好多可能的问题... 我觉得最快的方法是 04/09 21:57
7F：→ licat:找一个你附近作cloning很顺的人 跟他一步步确认你的做法 04/09 21:58
8F：→ licat:最好是可以请他帮你做 全照他的方式来做 然後你在旁边看跟学 04/09 21:58
9F：→ blence:PCR产物有1ug以上,好奇你如何定量的,如果真用这麽多还做不 04/10 00:21
10F：→ blence:出来,实在需要找个会做的人在旁指导了,不少描述都有问题 04/10 00:22
11F：推 joseph103331:甚麽是直接纯化.... 04/10 02:46
12F：→ joseph103331:问一下 你选的位置应该没有转译起始点吧? 04/10 02:47
14F：→ mesenchymal:好巧不巧 这两个酵素没多留几个mer切再久效率都很差 04/10 07:18
15F：推 mesenchymal:看推文你似乎没多放,所以先从这着手吧 04/10 07:21
16F：→ jeffsu:这部分我们实验室也算刚入门能问的人不多 很感谢大家的回答 04/10 10:45
17F：→ jeffsu:我在研究看看 04/10 10:45
18F：→ jeffsu:回j大 这段序列没包含到转译起始点 04/10 10:56
19F：→ jeffsu:不知道是不是需要包含到? 04/10 11:01
20F：推 HEK293:做TA也是可以。 04/10 11:56
21F：→ jeffsu:用pfx去PCR 好像不能用TA作的样子 04/10 13:01
22F：推 HEK293:加个a而已........= =做个tailing 04/10 13:38
23F：→ jeffsu:了解了 感谢指导!! 04/10 16:23
24F：推 chaunen:我觉得问题应该就是mesenchymal大大说的..Y 04/12 01:18
25F：→ chaunen:所以inser其实没有被切 也就接不上罗 04/12 01:19
26F：→ chaunen:ligation product可以拿去跑PCR先check 很快就知道结果了 04/12 01:20
27F：→ chaunen:cloning还是一步一步check比较能找出问题. 04/12 01:28