作者licat (licat)
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標題Re: [求救] High Range DNA Ladder
時間Fri Apr 5 19:03:54 2013
我想你的目的應該是, 要確認這個接好的15 kb質體是不是正確地被構築
如果是這樣, 其實你應該先確認你的質體上限制脢的切位
選擇適合的數種限制脢組合來切割你的質體後, 再跑電泳確認是否如預期大小
例如本來15 kb大小的質體預期被...
BamHI切割後, 會變成 1 kb + 8kb + 6 kb
SalI切割後, 會變成 3 kb + 5 kb + 7 kb
XbaI切割後, 會變成 5kb + 8 kb + 2 kb
XhoI+EcoRV切割後, 會變成 2 kb + 3 kb +10 kb
等等, 然後分別進行酵素反應後, 再跑電泳確認是否如你的預期, 以這種方式來確認
所以你最好先知道你接到pBR322的各個片段中, 有甚麼酵素切位
如果有某個片段是你不知道序列, 所以無法預測酵素切位的, 也沒關係
至少你一定知道pBR322, DsRed...這些的序列, 就可以用以選擇該使用那些酵素了
因此其實你不需要買那個大片段的marker, 因為你們似乎沒有適合的電泳設備
然後分析大片段又比較麻煩跟不準確
而且環狀跟線狀DNA電泳速率不同, 是沒有辦法互相比較的
(質體一定要經過限制脢切割後才能與線狀DNA marker比較)
這是我的建議, 歡迎討論 :)
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◆ From: 36.229.210.193
1F：推 fvf:所以一次使用2種以上的酵素做切割是可行的嗎? 04/05 19:11
2F：→ fvf:我建構之後的replicon質體是已經有做過定序的 04/05 19:12
3F：→ fvf:只是還想要更貪心一點，做出全長clone 04/05 19:13
4F：→ fvf:只是初步做的時候會因為片段大小增加不明顯 04/05 19:13
5F：→ fvf:所以想試試看這種大範圍的DNA marker 04/05 19:14
6F：→ fvf:感謝您的想法，等連假結束後我可以試試看，非常感謝您! 04/05 19:15
7F：→ licat:一次切割兩種以上酵素是可行的 只是要注意buffer相容性 04/05 19:16
8F：→ licat:不大確定你的定序方式是? 04/05 19:17
9F：→ licat:一般的定序方式只能確認大概1 kb片段吧 04/05 19:18
10F：→ licat:而且無法確認你接進去的方向性是否正確 等等問題 04/05 19:19
11F：推 fvf:以酵素切割做初步大小的確認，再以多組引子送生技公司定序 04/05 19:21
12F：→ fvf:每個片段都是以兩種不同酵素切位做專一性連接 04/05 19:22
13F：→ licat:了解~ 04/05 19:25
14F：→ blence:推這一篇,而且文章內已經提到不需用兩種酵素切,你應該找一 04/05 20:15
15F：→ blence:個酵素具有多點切位的作用當作fingerprinting方式確認size 04/05 20:18
16F：→ BGG:單一enzyme有多個切位也行，主要是讓你容易在跑電泳的時候分析 04/06 01:04
17F：推 leoblack:看到這樣的發問~我好奇你知道DNA marker是用來標定linear 04/06 01:06
18F：→ leoblack:DNA的嘛?!也就是15K DNA不切成linear會跟marker對不起來 04/06 01:07