作者licat (licat)
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标题Re: [求救] High Range DNA Ladder
时间Fri Apr 5 19:03:54 2013
我想你的目的应该是, 要确认这个接好的15 kb质体是不是正确地被构筑
如果是这样, 其实你应该先确认你的质体上限制脢的切位
选择适合的数种限制脢组合来切割你的质体後, 再跑电泳确认是否如预期大小
例如本来15 kb大小的质体预期被...
BamHI切割後, 会变成 1 kb + 8kb + 6 kb
SalI切割後, 会变成 3 kb + 5 kb + 7 kb
XbaI切割後, 会变成 5kb + 8 kb + 2 kb
XhoI+EcoRV切割後, 会变成 2 kb + 3 kb +10 kb
等等, 然後分别进行酵素反应後, 再跑电泳确认是否如你的预期, 以这种方式来确认
所以你最好先知道你接到pBR322的各个片段中, 有甚麽酵素切位
如果有某个片段是你不知道序列, 所以无法预测酵素切位的, 也没关系
至少你一定知道pBR322, DsRed...这些的序列, 就可以用以选择该使用那些酵素了
因此其实你不需要买那个大片段的marker, 因为你们似乎没有适合的电泳设备
然後分析大片段又比较麻烦跟不准确
而且环状跟线状DNA电泳速率不同, 是没有办法互相比较的
(质体一定要经过限制脢切割後才能与线状DNA marker比较)
这是我的建议, 欢迎讨论 :)
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 36.229.210.193
1F：推 fvf:所以一次使用2种以上的酵素做切割是可行的吗? 04/05 19:11
2F：→ fvf:我建构之後的replicon质体是已经有做过定序的 04/05 19:12
3F：→ fvf:只是还想要更贪心一点，做出全长clone 04/05 19:13
4F：→ fvf:只是初步做的时候会因为片段大小增加不明显 04/05 19:13
5F：→ fvf:所以想试试看这种大范围的DNA marker 04/05 19:14
6F：→ fvf:感谢您的想法，等连假结束後我可以试试看，非常感谢您! 04/05 19:15
7F：→ licat:一次切割两种以上酵素是可行的 只是要注意buffer相容性 04/05 19:16
8F：→ licat:不大确定你的定序方式是? 04/05 19:17
9F：→ licat:一般的定序方式只能确认大概1 kb片段吧 04/05 19:18
10F：→ licat:而且无法确认你接进去的方向性是否正确 等等问题 04/05 19:19
11F：推 fvf:以酵素切割做初步大小的确认，再以多组引子送生技公司定序 04/05 19:21
12F：→ fvf:每个片段都是以两种不同酵素切位做专一性连接 04/05 19:22
13F：→ licat:了解~ 04/05 19:25
14F：→ blence:推这一篇,而且文章内已经提到不需用两种酵素切,你应该找一 04/05 20:15
15F：→ blence:个酵素具有多点切位的作用当作fingerprinting方式确认size 04/05 20:18
16F：→ BGG:单一enzyme有多个切位也行，主要是让你容易在跑电泳的时候分析 04/06 01:04
17F：推 leoblack:看到这样的发问~我好奇你知道DNA marker是用来标定linear 04/06 01:06
18F：→ leoblack:DNA的嘛?!也就是15K DNA不切成linear会跟marker对不起来 04/06 01:07