作者b715306 (miu)
看板Biotech
標題[求救] Co-IP
時間Mon Mar 25 12:45:00 2013
嗨 大家好!!
小妹我的coIP實驗結果很奇怪，
染出來的band蠻雜的，而且都很亮，但偏偏就沒有我要看的目標kDa ...
所以想請教大家，不知道是不是實驗方法還是哪邊出了問題
我做的實驗步驟是:
將萃取好的protein定量後加入A抗體及PBS室溫搖晃反應overnight
再加入protein A/G 搖約120分鐘(室溫
離心後，用PBS清洗三次，去上清液後留下沉澱物
再加入dye，95度下反應後把上清液拿來跑western再染抗體B
請問這樣子的實驗步驟是正確的嗎?
染完膜後kDa 是要看B的對不對?
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 210.70.174.13
1F：→ trumpet:B只是拿來染western，並沒有跑SDS-PAGE不是嗎?? 03/25 12:49
2F：→ a90648:先染個A看看有有沒抓下來吧 03/25 12:51
3F：→ blence:很少人忍心讓lysate室溫下被抗體抓整天,protocol有來源嗎？ 03/25 13:42
4F：→ blence:看一下你的A,B的MW,上述各抗體物種,大概就有機會知道原因了 03/25 13:45
5F：推 soend:我會先染A 確定有抓到 再染B 另外我們是四度一晚 蛋白用室溫 03/25 16:48
6F：→ soend:挺危險的吧? 還是有其他文獻是這樣子做的? 03/25 16:49
7F：推 Locutus:室溫overnight?? 你的protocol哪來的… 03/26 10:45
8F：→ b715306:Protocol是買protein A/G附的 SANTA CRUZ的 03/26 18:38
9F：→ b715306:室溫大概25度，Protocol上寫要4度C ，但老闆是說 他以前做 03/26 18:39
10F：→ b715306:在25度C下(也就是室溫，是ok的 03/26 18:40
11F：推 owl628:真的很少人會把蛋白在室溫下做Co-IP..... 03/26 22:37
12F：→ kirby0415:室溫.... 03/26 22:57
13F：→ blence:雖然每個人都在意室溫,原po可別當真的拿ptt的推文反駁老師 03/26 23:07
14F：推 joseph103331:問一下 染出來的kDa是否都比B小? 如果是的話.... 03/27 00:23
15F：→ joseph103331:大概被降解的可能挺高的 03/27 00:23
16F：→ joseph103331:還有順便確認一下Input裡面AB是否都正常呢? 03/27 00:24
17F：→ joseph103331:你可以取一些lysate出來不加sample buffer一起擺室溫 03/27 00:26
18F：→ joseph103331:看看室溫的影響為何.... 03/27 00:27
19F：→ joseph103331:不過你還是照個protocol跑一遍吧 室溫這麼久 03/27 00:27
20F：→ joseph103331:蛋白質不壞 抗體都不知道行不行了 03/27 00:27
21F：推 apple23418:恩 你老板似乎很喜歡你,要讓你留下來慢慢做,通常prote 03/28 01:18
22F：→ apple23418:in AG加進去後是會放4℃歐 03/28 01:18
23F：→ b715306:恩..我是助理 不是研究生所以~跟老闆有沒有要留我下來應 03/28 11:23
24F：→ b715306:該枚關係吧 哈哈哈... 03/28 11:24
25F：→ b715306:還有謝謝大家，我會依照建議再做做看 03/28 11:25