作者b715306 (miu)
看板Biotech
标题[求救] Co-IP
时间Mon Mar 25 12:45:00 2013
嗨 大家好!!
小妹我的coIP实验结果很奇怪，
染出来的band蛮杂的，而且都很亮，但偏偏就没有我要看的目标kDa ...
所以想请教大家，不知道是不是实验方法还是哪边出了问题
我做的实验步骤是:
将萃取好的protein定量後加入A抗体及PBS室温摇晃反应overnight
再加入protein A/G 摇约120分钟(室温
离心後，用PBS清洗三次，去上清液後留下沉淀物
再加入dye，95度下反应後把上清液拿来跑western再染抗体B
请问这样子的实验步骤是正确的吗?
染完膜後kDa 是要看B的对不对?
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 210.70.174.13
1F：→ trumpet:B只是拿来染western，并没有跑SDS-PAGE不是吗?? 03/25 12:49
2F：→ a90648:先染个A看看有有没抓下来吧 03/25 12:51
3F：→ blence:很少人忍心让lysate室温下被抗体抓整天,protocol有来源吗？ 03/25 13:42
4F：→ blence:看一下你的A,B的MW,上述各抗体物种,大概就有机会知道原因了 03/25 13:45
5F：推 soend:我会先染A 确定有抓到 再染B 另外我们是四度一晚 蛋白用室温 03/25 16:48
6F：→ soend:挺危险的吧? 还是有其他文献是这样子做的? 03/25 16:49
7F：推 Locutus:室温overnight?? 你的protocol哪来的… 03/26 10:45
8F：→ b715306:Protocol是买protein A/G附的 SANTA CRUZ的 03/26 18:38
9F：→ b715306:室温大概25度，Protocol上写要4度C ，但老板是说 他以前做 03/26 18:39
10F：→ b715306:在25度C下(也就是室温，是ok的 03/26 18:40
11F：推 owl628:真的很少人会把蛋白在室温下做Co-IP..... 03/26 22:37
12F：→ kirby0415:室温.... 03/26 22:57
13F：→ blence:虽然每个人都在意室温,原po可别当真的拿ptt的推文反驳老师 03/26 23:07
14F：推 joseph103331:问一下 染出来的kDa是否都比B小? 如果是的话.... 03/27 00:23
15F：→ joseph103331:大概被降解的可能挺高的 03/27 00:23
16F：→ joseph103331:还有顺便确认一下Input里面AB是否都正常呢? 03/27 00:24
17F：→ joseph103331:你可以取一些lysate出来不加sample buffer一起摆室温 03/27 00:26
18F：→ joseph103331:看看室温的影响为何.... 03/27 00:27
19F：→ joseph103331:不过你还是照个protocol跑一遍吧 室温这麽久 03/27 00:27
20F：→ joseph103331:蛋白质不坏 抗体都不知道行不行了 03/27 00:27
21F：推 apple23418:恩 你老板似乎很喜欢你,要让你留下来慢慢做,通常prote 03/28 01:18
22F：→ apple23418:in AG加进去後是会放4℃欧 03/28 01:18
23F：→ b715306:恩..我是助理 不是研究生所以~跟老板有没有要留我下来应 03/28 11:23
24F：→ b715306:该枚关系吧 哈哈哈... 03/28 11:24
25F：→ b715306:还有谢谢大家，我会依照建议再做做看 03/28 11:25