作者xilo129 (游水的魚)
看板Biotech
標題[討論] luciferase assay相關問題
時間Fri Mar 22 13:10:57 2013
麻煩大家
解決我面臨到的問題(如果做出來，我就可以順利畢業了>"<)
以下是我的問題:
我找到兩個miRNA，然後用線上預測網站去預測他的TARGET GENE
找到之後，在細胞內大量表現我的miRNA
用WESTERN BLOT 看到我要看的PROTEIN 表現量有下降(先偷看有沒有作用)
之後就要用LUCIFERASE ASSAY去證明，我的miRNA會不會直接跟我的TARGET GENE BINDING
但是我的Luciferase 沒有被壓下來或是有時候有壓下來。我調過target gene與miRNA之間的比例(1:1,1:3,1:4)
也看過Transfection 24hr,48hr
這樣的結果是在說明，我的miRNA跟我的TARGET GENE沒有直接Binding的關係嗎???
這樣子，我又要如何走我的下一步呢????
麻煩你們給我一點方向
以下是我transfection 的condition
transfection reagent:lipofetamine LTX
Seeding in 24 well plate
每個well的plasmid量
A
miRNA construct 250ng
target gene construct 250ng
renilla 13ng
opti-mem 50ul
B
lipo 2ul
opti-mem 50ul
A+B MIX
在加入WELL中並補400ul medium
過3hr換medium
放24hr
麻煩各位了(鞠躬~~)
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.121.119
1F：推 HEK293:有沒有直接binding，我想還是需要個control (mutant) 03/22 13:23
2F：→ HEK293:transfection看起來問題應該不大，先確定target的UTR序列 03/22 13:23
3F：→ HEK293:然後miRNA是否真的over-expressed。 03/22 13:23
4F：→ HEK293:construction是自製還是commercialized product？ 03/22 13:24
5F：→ HEK293:必要時可以考慮RIP跑Ago2看看 03/22 13:24
6F：→ xilo129:都是自製construct的 03/22 14:42
7F：→ xilo129:RIP跑Ago2是??? 03/22 14:45
8F：推 HEK293:有直接看binding的方法是cotransfect AGO2跟target UTR後IP 03/22 16:36
9F：→ HEK293:AGO2下來跑qPCR來看。類似ChIP的作法。 03/22 16:37
10F：→ HEK293:另外reporter的作法需要mutant form做nega. cont.比較好 03/22 16:38
11F：→ xxtomnyxx:你找到的miRNA targeting 的gene序列是在 5'-UTR 上嗎？ 03/22 20:22
12F：→ xxtomnyxx:一般來說 Luc Assay 檢測的是 gene promoter 的活性， 03/22 20:22
13F：→ xxtomnyxx:如果 miRNA 作用的序列是在 CDS 上，是不能用 Luc Assay 03/22 20:23
14F：→ xxtomnyxx:去看的吧？ 03/22 20:24
15F：推 aceliang:一般通常是3'UTR，luc assay可以把該基因的UTR放fluc的3' 03/22 22:14
16F：→ aceliang:市面上也有這類型的reporter system。pMIR-report系列等 03/22 22:15
17F：推 TAKONA:mutant要一起做+1 03/22 23:36
18F：→ TAKONA:另外推薦psiCHECK-2，有IRES-drived internal control 03/22 23:36
19F：→ TAKONA:方便又好用 03/22 23:37
20F：→ TAKONA:但這也是用3'-UTR 03/22 23:37
21F：推 joseph103331:你有每次都確認miRNA有作用嗎? 如果沒有的話.... 03/23 20:27