作者xilo129 (游水的鱼)
看板Biotech
标题[讨论] luciferase assay相关问题
时间Fri Mar 22 13:10:57 2013
麻烦大家
解决我面临到的问题(如果做出来，我就可以顺利毕业了>"<)
以下是我的问题:
我找到两个miRNA，然後用线上预测网站去预测他的TARGET GENE
找到之後，在细胞内大量表现我的miRNA
用WESTERN BLOT 看到我要看的PROTEIN 表现量有下降(先偷看有没有作用)
之後就要用LUCIFERASE ASSAY去证明，我的miRNA会不会直接跟我的TARGET GENE BINDING
但是我的Luciferase 没有被压下来或是有时候有压下来。我调过target gene与miRNA之间的比例(1:1,1:3,1:4)
也看过Transfection 24hr,48hr
这样的结果是在说明，我的miRNA跟我的TARGET GENE没有直接Binding的关系吗???
这样子，我又要如何走我的下一步呢????
麻烦你们给我一点方向
以下是我transfection 的condition
transfection reagent:lipofetamine LTX
Seeding in 24 well plate
每个well的plasmid量
A
miRNA construct 250ng
target gene construct 250ng
renilla 13ng
opti-mem 50ul
B
lipo 2ul
opti-mem 50ul
A+B MIX
在加入WELL中并补400ul medium
过3hr换medium
放24hr
麻烦各位了(鞠躬~~)
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.121.119
1F：推 HEK293:有没有直接binding，我想还是需要个control (mutant) 03/22 13:23
2F：→ HEK293:transfection看起来问题应该不大，先确定target的UTR序列 03/22 13:23
3F：→ HEK293:然後miRNA是否真的over-expressed。 03/22 13:23
4F：→ HEK293:construction是自制还是commercialized product？ 03/22 13:24
5F：→ HEK293:必要时可以考虑RIP跑Ago2看看 03/22 13:24
6F：→ xilo129:都是自制construct的 03/22 14:42
7F：→ xilo129:RIP跑Ago2是??? 03/22 14:45
8F：推 HEK293:有直接看binding的方法是cotransfect AGO2跟target UTR後IP 03/22 16:36
9F：→ HEK293:AGO2下来跑qPCR来看。类似ChIP的作法。 03/22 16:37
10F：→ HEK293:另外reporter的作法需要mutant form做nega. cont.比较好 03/22 16:38
11F：→ xxtomnyxx:你找到的miRNA targeting 的gene序列是在 5'-UTR 上吗？ 03/22 20:22
12F：→ xxtomnyxx:一般来说 Luc Assay 检测的是 gene promoter 的活性， 03/22 20:22
13F：→ xxtomnyxx:如果 miRNA 作用的序列是在 CDS 上，是不能用 Luc Assay 03/22 20:23
14F：→ xxtomnyxx:去看的吧？ 03/22 20:24
15F：推 aceliang:一般通常是3'UTR，luc assay可以把该基因的UTR放fluc的3' 03/22 22:14
16F：→ aceliang:市面上也有这类型的reporter system。pMIR-report系列等 03/22 22:15
17F：推 TAKONA:mutant要一起做+1 03/22 23:36
18F：→ TAKONA:另外推荐psiCHECK-2，有IRES-drived internal control 03/22 23:36
19F：→ TAKONA:方便又好用 03/22 23:37
20F：→ TAKONA:但这也是用3'-UTR 03/22 23:37
21F：推 joseph103331:你有每次都确认miRNA有作用吗? 如果没有的话.... 03/23 20:27